细胞污染类型与常见处理方式

对于需要用细胞做实验的人来说，污染绝对是能让人“暴走”的问题。战战兢兢养了大半个月的细胞一夜之间全军覆没带来的打击，想必养细胞的人都不陌生。污染，简直就是细胞实验的魔咒，让一切陷入无尽的循环当中……

本期内容小恒整理了细胞培养常见的生物污染类型、解决方案以及细胞房的操作规范，希望能给养细胞的小伙伴们带来帮助。

1. 细菌污染

污染来源：

操作不规范或无菌措施不到位等。

常见菌种：

白色葡萄球菌、大肠杆菌、假单孢菌、枯草杆菌等。

污染特征：

显微镜下可观察到大小不一（0.5～5μm）的物质，比细胞小很多，低倍镜下呈沙粒状布满细胞间隙或培养基，高倍镜下多呈球状或杆状，形态规则，分布均匀，镜下观察有明显的定向运动；增殖速度快，一般污染后48~72h爆发式增殖；营养消耗快，培养基pH发生变化，颜色很快变黄，变浑浊，甚至可能有明显的异味；细胞生长缓慢，形态发生改变甚至脱落死亡。

处理建议：

轻度污染或细胞比较珍贵：可用10～20×双抗清洗处理。吸出培养基，以PBS清洗2～3遍，加胰酶消化至细胞形态略有变化但未脱离容器底部，加PBS轻轻润洗1次后加入20×高浓度双抗浸泡细胞3～5min，弃双抗；加入含10×双抗的无污染完全培养基正常培养12h后正常传代，并仍以含10×双抗的完培进行培养，若第二代镜下未观察到细菌，第三代则可用正常培养基培养，传代48h后无反弹认为污染已清除。重度污染建议直接消杀丢弃后对培养箱进行彻底消毒。为预防细菌感染，建议日常培养基中正常添加双抗。

2. 真菌污染

污染来源：

一般是来自实验服，并且具有气候性，多雨、气候湿润的季节容易出现。

常见菌种：

曲霉菌、白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌、孢子菌等。

污染特征：

肉眼下可观察到培养液中有淡黄色或是白色的点状漂浮物，短期内培养基一般不变混浊。倒置显微镜下可见细胞之间有絮状交错的菌丝或菌团，在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。细胞被污染后仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。

处理建议：

在PBS润洗、换液后可加入两性霉素B（注意两性霉素B有细胞毒性，使用后可能会有副作用），也可加入300μg/mL氟康唑培养，污染控制后改用150μg/mL培养2~3代。但真菌污染一般难以根除，若非必要，建议消杀后丢弃，对细胞房、培养箱、操作台以及器皿和培养液等进行全面消毒。

3. 支原体污染

污染来源：

血清、胰酶、已污染物的气溶胶、操作人员的口腔及皮肤等。

常见种类：

口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体等。直径约为 0.1～0.3 μm，具有变形能力，可通过过滤膜（0.22-0.45 μm）。

污染特征：

细胞增殖减慢，镜下观察碎点变多、细胞边界变得模糊、形态异常（拉丝、铺展）、胞浆出现小颗粒或空泡，状态越来越差；培养条件未变，培养基清澈；更换新的培养液，细胞状态没有恢复。支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。

鉴定方法：

分离培养法、PCR法、ELISA、DNA荧光染色法、电镜等。

处理建议：

支原体污染十分麻烦，若细胞已受支原体污染，最佳的处理方式是将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株，培养箱的其他细胞可用支原体抑制培养基培养1～2代，以作预防，并使用支原体环境消毒试剂进行环境消毒。

对于珍稀细胞：

1）采用支原体抑制试剂处理细胞，根据相关指南使用，周期结束后可以进行鉴定。

2）清洗纯化法，由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使潜在支原体数量降低至极限，并结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到较好的效果，但极有可能无法根除；

3）支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可抑制支原体生长，一般抗血清处理后11天即可转为阴性。

4）巨噬细胞吞噬法：将巨噬细胞与被支原体污染细胞共培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体被消除干净为止。

5）使用支原体抗体培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌PBS洗涤细胞1~2次，保持适当细胞密度；处理15天后，用支原体检测试剂盒检测支原体是否完全清除；

6）为避免细胞再次受到支原体污染，应每隔1月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

4. 黑胶虫污染

污染来源：

“黑胶虫”是一种常见的细胞污染物，暂无明确定义，可存在于动物细胞，也可以生存于培养基中，随细胞传代而传代，是一种异养物质，主要来源为血清。

污染特征：

主要表现为细胞状态差，培养基不浑浊，但镜下观察细胞周围和培养液中出现很多黑点和碎片多，做布朗运动，且随着培养时间的延长黑点和碎片逐渐增多，更换培养液或洗涤不能将其去除；“黑胶虫”与细胞竞争性生长，严重时导致细胞死亡。

处理建议：

对于黑胶虫污染的细胞，最快速有效的处理方式是使用黑胶虫清除剂，同时确保培养体系中的血清必须为无黑胶虫污染的优质血清。非珍稀或污染严重细胞建议直接丢弃。

5. 细胞交叉污染

污染来源：

细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会出现细胞交叉污染。目前，已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

鉴定方式：

同种属进行STR鉴定，多等位基因数大于3个。（需考虑本身的遗传背景，如EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息）；不同种属进行PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。

处理建议：

建议重新引种。

预防建议：

尽量避免多细胞同时操作，如传代等；器具和培养溶液避免交叉使用。

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