常见的细胞污染-支原体污染预防、检测与治理

支原体（mycoplasma）是一种没有细胞壁的最小原核细胞。在细胞培养过程中，支原体污染率达到60%以上，当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，污染严重时细胞生长缓慢，细胞形态发生改变，并出现细胞病变。因而细胞培养过程中，防止支原体污染是一个世界性的难题。

支原体污染细胞后很难察觉，同时若细胞培养过程受到了支原体污染，彻底清除支原体也是非常困难的。因此在细胞培养过程中，定期进行支原体检测，在源头上清除支原体污染，并做好支原体预防工作显得尤为重要。

首先来判断支原体污染常见表现：

1.细胞状态变差、生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不浑浊；

2.细胞传代以后就出现细胞间黑点、细胞空泡化或者很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。

图1.（左）支原体污染的细胞（右）正常细胞

由于支原体缺乏细胞壁，所以常规的抗生素并不能对它们起到抵抗作用，而且由于其直径太小，滤菌器也无法过滤。一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：

1. 试剂盒检测法：

目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用汉恒生物HB-SVDR支原体检测试剂盒。

2. 观察细胞的形态和生长特征：

支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。

3. 分离培养法：

大多数支原体可出现特有的典型菌落。因而可依次尽心检测，该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。

4. DNA结合荧光素染色法：

利用荧光染剂侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之A-T区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。

5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。

6. 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强。

7. 使用支原体通用引物，PCR扩增检测支原体。

组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：

控制环境污染；

严格实验操作；

细胞培养基和器材要保证无菌；

在细胞培养基中加入适量的抗生素。

当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留，可以采取以下治理方式：

1. 支原体清除试剂

例如，汉恒Savelt抗支原体试剂

2. 清洗纯化法

通过反复洗涤细胞和低速离心换液，使细胞外寄生的支原体数量降低至极限，此方法极可能无法彻底根除。

3. 支原体特异性血清法

用5%的兔支原体免疫血清和5%太牛血清培养污染细胞，处理后约11天可转为阴性。

4. 巨噬细胞吞噬法

将巨噬细胞与被污染的细胞共同培养，巨噬细胞可以吞噬培养基中的支原体

处理完成后建议再次检测支原体，并定期进行常规检测，同时使用汉恒包含抗支原体试剂的三抗进行预防，平时也可使用抗支原体喷雾喷洒实验设备及细胞房进行环境防治。

汉恒生物支原体防治产品，全方位360°防治支原体污染：