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在前面的文章中我们介绍了与细胞生长有关的细胞增殖和细胞凋亡实验，那么本期我们将目光聚焦于细胞的运动方面，主要介绍细胞迁移和侵袭实验。迁移和侵袭是细胞生物学中两个至关重要的过程，它们在胚胎发育、免疫反应、伤口愈合以及肿瘤转移等过程中发挥关键作用，探讨其中的机制对于基础研究和临床应用都具有重要意义。
细胞迁移（cell migration）是指细胞在接收到特定信号刺激后，通过其自身的运动能力，从原来的位置移动到新位置的过程，这种运动通常是定向的，且涉及细胞前端的延伸、后端的收缩以及胞体的滑动。胚胎发育（如神经元迁移、血管生成）、炎症反应（如白细胞趋化至炎症部位、伤口愈合以及肿瘤扩散）等多个生理和病理过程都涉及细胞迁移。
图1. 细胞迁移过程示意图
细胞侵袭（cell invasion）则是细胞迁移的一种特殊形式，它不仅要求细胞能够移动，还需要细胞具备穿透细胞外基质（ECM）或基底膜的能力。在病理情况下，尤其是恶性肿瘤中，侵袭性细胞能够大量分泌胶原酶等破坏ECM，进而使细胞可以穿过基质进入周围组织甚至远端器官。这一过程对于肿瘤的局部浸润和转移至关重要。
图2. 肿瘤细胞侵袭过程(DOI：10.1152/physiol.00009.2005)
可见，迁移主要指细胞在相对开放的基质上滑行或爬行，而侵袭则涉及细胞对硬质或密集基质的降解与穿透，说明具有侵袭能力的细胞一定可以发生迁移，但可发生迁移的细胞不一定具有侵袭能力。简言之，迁移是细胞响应信号的被动性运动，而侵袭则是细胞主动重塑周围环境以实现深层次的渗透。
但是，细胞迁移和侵袭与细胞增殖并非孤立事件，它们是相互联系、协同调控的过程。一方面，增殖能力强的细胞群体可以为迁移或侵袭提供细胞数量上的支持，特别是在肿瘤生长过程中，快速增殖的肿瘤细胞中一部分可能获得迁移或侵袭能力，促进肿瘤的扩散。另一方面，迁移和侵袭过程本身也可能影响细胞增殖。例如，到达新环境的迁移细胞可能会受到不同的微环境信号刺激，调整其增殖状态以适应新的环境；而成功侵袭的肿瘤细胞在新的组织中往往表现出更强的增殖活性，进一步推动肿瘤发展。因此，在研究肿瘤发生发展过程中，细胞增殖、迁移和侵袭能力的检测通常是必不可少的，是评估肿瘤细胞生长和转移能力的重要指标。
目前有多种实验技术可以观察和量化细胞的迁移和侵袭能力，常见的方法有划痕实验（Scratch Assay）、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞迁移和侵袭实验以及活体成像技术（Live Imaging Techniques）等。这里我们主要介绍划痕实验（Scratch Assay）、Transwell迁移和侵袭实验两种评估细胞迁移和侵袭能力的方法。
划痕实验（Scratch Assay）
细胞划痕实验是一种用来评估细胞迁移能力的体外实验方法。它通过模拟细胞在体外培养时形成的单层细胞被物理性划伤后，向空白区域移动填补的过程。这个迁移过程类似于伤口愈合，因此又可称为伤口愈合实验（Wound Healing Assay）。
图3. 细胞迁移结果实例（DOI： 10.1083/jcb.200208050）
1、实验目的：
划痕实验通常可以用于评估不同处理因素对细胞迁移能力的影响，进而达到探讨一些科研问题的目的，例如：
（1）药物筛选：评估药物对细胞迁移的影响，这在一些药物开发过程中非常重要；
（2）基因功能研究：通过调控特定基因的表达，来研究这些基因对细胞迁移能力的影响，或是验证细胞迁移相关信号通路的功能；
（3）疾病模型：模拟某些疾病状态下的细胞迁移行为，如肿瘤侵袭和伤口愈合过程；
（4）细胞行为研究：了解细胞在不同条件下的迁移行为，包括对环境变化的响应、细胞间相互作用。
2、主要实验试剂和仪器
完全培养基，基础或低血清培养基，PBS，6孔板，移液枪，200μl枪头，直尺，马克笔，显微镜等。
3、实验操作步骤
（1）划线：所有需无菌操作的试剂耗材进行灭菌，用马克笔和直尺于6孔板底部划5条等宽的横线，作为后续的观察标记；
（2）细胞培养：将细胞均匀接种至6孔板，培养至形成完整的单层细胞；
（3）细胞划痕：用200μl枪头垂直于6孔板和之前标记的横线，沿着孔的中线进行划痕，形成“伤口”，划痕和横线的交点可作为固定的观察点；
图4. 6孔板划线示意图，灰色横线为标记线，绿色竖线表示划痕
（4）洗涤：弃去原培养基，用PBS洗涤以去除划落的细胞碎片和培养基中的血清成分；
（5）培养和观察：继续培养细胞，并在设定时间点（如0、12、24h）使用显微镜观察并拍照记录细胞迁移情况；
（6）图像分析：使用图像分析软件（如Image J）测量划痕区域的愈合程度，计算划痕两边细胞间的距离均值或划痕面积，进一步计算出细胞迁移率：
细胞迁移率=（初始划痕距离—某一时间点划痕距离的均值）/初始划痕距离
或 细胞迁移率=（初始划痕面积—某一时间点划痕面积）/初始划痕面积
4、常见注意事项
（1）划痕的一致性：确保划线时枪头垂直于孔板并均匀用力，一气呵成，使每次划痕的宽度一致，以获得可进行比较的结果；
（2）细胞密度：细胞接种密度要合适，以确保充分的接触抑制，避免因过度拥挤影响迁移；
（3）培养基成分：使用无血清或低血清培养基，也可以提前加入丝裂霉素C来抑制细胞分裂，以减少细胞增殖对迁移结果的干扰；
（4）适度洗涤：划痕后用PBS洗涤时避免用力冲洗，防止划痕边缘的细胞也被冲走；
（5）实验重复性：每个实验组应设置多个重复，以确保数据的可靠性和统计意义；
（6）时间点选择：选择合理的时间点进行观察，太早可能观察不到明显变化，太晚则可能因细胞增殖影响结果；
（7）避免边缘效应：在分析时，注意排除由于培养板边缘造成的迁移偏差。
（8）图像处理：在拍照时，确保光线均匀，对比度适宜，以便后续分析。
（9）细胞类型特性：不同细胞类型迁移能力不同，实验条件需根据细胞特性进行优化。
（10）若需对细胞进行药物处理或调节基因表达等操作，可根据具体实验设计在合适的时间做处理。例如需评估药物对细胞状态的长期影响，则可在划痕前对细胞先进行一定时间的药物预处理。
Transwell迁移和侵袭实验
Transwell实验是一种既可以评估细胞迁移能力、还能有效评估侵袭能力的实验技术。Transwell小室通过模拟细胞穿越基底膜的行为，来研究细胞的运动性，广泛应用于肿瘤学、免疫学和细胞生物学等领域。根据是否需要在小室多孔膜上添加基质胶可将Transwell小室分为两种类型：
①未添加基质胶的用于测定细胞迁移；
②添加基质胶的可用于检测侵袭能力，因细胞侵袭涉及对细胞外基质的降解，所以添加基质胶能很好地模拟体内过程。
图5. Transwell细胞小室（DOI： 10.1385/1-59259-860-9:097 ）
1、实验目的：
Transwell小室由一个多孔的聚碳酸酯膜和上下两个室组成，类似于在一个杯子中间置入一层多孔隔断而分成上下两层，上层称为上室，下层称为下室。细胞被接种在上室，而下室包含诱导细胞迁移的成分，可以是另一种细胞也可以是人为添加趋化因子等。随后，细胞通过膜上的孔隙迁移到下室，这一过程模拟了细胞在体内穿越基底膜和细胞外基质的行为。因此在研究处理因素对目的细胞的迁移和侵袭能力的影响，以及细胞间相互作用等对细胞迁移和侵袭的影响。
图6. Transwell实验原理（DOI: 10.1007/978-1-0716-3052-5_22）
2、主要实验试剂和仪器
细胞，完全培养基，基础培养基，Matrigel基质胶（如需），活细胞染料（如结晶紫染液），4%多聚甲醛固定液，Transwell小室，24孔板，细胞计数器，倒置显微镜或荧光显微镜等。
3、实验操作步骤
（1）准备细胞：取生长状态良好的细胞进行饥饿处理约24 h，以同步细胞周期，减少增殖对实验结果的影响；
（2）准备Transwell小室：根据实验设计，选择是否添加基质胶，基质胶的制备和包被可参考具体说明书；
（3）细胞悬液制备：将制备好的细胞消化重悬，用无血清培养基调整细胞浓度至适当密度。
（4）添加诱导因素：在下室加入适量的诱导剂，例如完全培养基；
（5）接种细胞：将细胞悬液加入Transwell上室。
（6）培养：将Transwell小室放回培养箱中，培养24-48h。
（7）固定和染色：实验结束后，用4%多聚甲醛固定细胞约30min，弃固定液后用PBS洗涤小室1次；然后用结晶紫染色10min，随后用PBS洗涤2-3次，以便于显微镜下观察。
（8）迁移/侵袭细胞计数：显微镜下随机选取3-5个视野，计数迁移到膜下侧的细胞数量。
（9）数据分析：根据计数结果，计算细胞迁移或侵袭的百分率或相关统计数据。
图7. 结果展示（DOI： 10.1385/1-59259-860-9:097 ）
4、常见注意事项
（1）避免气泡：在操作过程中避免在上室或下室中产生气泡，这可能会干扰细胞迁移。
（2）涂层均匀性：如果使用Matrigel或其他涂层，确保涂层均匀以获得一致的实验结果。
（3）细胞密度：播种细胞时，确保细胞密度适当，过高或过低都可能影响迁移效果。
（4）培养时间和条件：实验的培养时间和条件需要根据细胞类型和实验目的进行优化。
（5）化学吸引剂浓度：下室的化学吸引剂浓度需要根据实验设计精确调整。
（6）膜的孔径：选择适合细胞大小的膜孔径，以确保细胞只能通过孔隙迁移。
（7）避免交叉污染：在操作过程中要小心避免不同样品之间的交叉污染。
（8）图像分析：使用一致的显微镜设置和图像分析方法来评估迁移细胞的数量。
（9）实验重复：进行足够次数的实验重复，以确保数据的可靠性和统计意义。
获得实验结果的方法除了染色和荧光计数外，对于有荧光染料标记的细胞还可以测定荧光强度，荧光强度与迁移细胞数量成正比。
另外，利用Transwell小室的结构特点，还可以进行细胞共培养，此时选择较小的孔径使细胞不能通过，分别在上室和下室接着相应的目的细胞，以研究下室中的细胞分泌物或代谢产物对上室细胞的影响。
总的来说，划痕实验是一种简单直观的评估细胞迁移能力的方法，操作比较简单，也不需要特殊的耗材和设备，可以直观的看到细胞迁移过程，主要侧重于细胞迁移的定量分析，但可能受到细胞增殖和边缘效应的影响，导致结果偏差。Transwell实验通过使用一些小孔作为细胞迁移的物理障碍，能够更准确地模拟细胞穿越基底膜的生物学过程，这种设计允许研究者观察到细胞在更接近生理状态下的迁移和侵袭行为，从而获得更可靠的数据。因此，当需要更细致地了解细胞迁移和侵袭行为时，Transwell实验便成为了首选。尽管Transwell实验在操作技术上要求较高，且成本相对较大，但它的优势在于能够提供直观、可靠的数据。通过严格控制实验条件可以大大提高实验的准确性和重复性。
综上，本期主要介绍了划痕实验和Transwell实验，包括实验目的、主要实验试剂和仪器，实验步骤和常见注意事项等。划痕实验和Transwell实验作为细胞运动方面的两个重要实验，为我们研究细胞功能提供了更多有力的证据，在下一期我们将继续介绍细胞功能实验相关的克隆形成实验相关内容，欢迎大家持续关注~
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