CRISPR/Cas9系统的“百变”应用-敲入篇

在上一系列的干货分享中，我们介绍了CRISPR-Cas9基因敲除系统（knock out）相关知识。接下来，我们将目光聚焦 CRISPR/cas9系统的另一应用——敲入，开启一个新的篇章。本篇文章主要从实验原理、HDR模板的选择和实验流程步骤三个方面来介绍CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）。

一、CRISPR基因敲入实验原理

CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的DNA元件，也可以是一段没有功能的DNA序列等。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA精准地插入特定的基因组位点。

目前CRISPR/Cas9 Gene Knock in系统可用于目的基因引入点突变，从而模拟人类遗传疾病模型；或者将报告基因(如EGFP，mCherry，BFP等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达；亦或将功能缺失的DNA片段修复为有功能的DNA片段，即可实现基因治疗的目的。此系统的应用范围不胜枚举，已成为人类生物学、医学、农业和微生物学等领域有力的基因编辑工具。

图1基于CRISPR/Cas9基因敲入的示意图（Murillo-Rodríguez E et al., 2018）

二、如何选择合适的CRISPR基因敲入HDR模板

基因敲入HDR模板的作用

在CRISPR基因敲入中，同源重组修复 (homology directed repair, HDR) 模板是一种用于指导修复DNA断裂并实现精确基因敲入的DNA序列，与目标基因组中被Cas9剪切的位置具有相同序列的同源臂。无HDR模板的CRISPR基因敲入，细胞通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）方式修复Cas9切割的DNA断裂。NHEJ修复方式速度快效率高，但易引起插入/缺失、突变等不良后果，故属于相对不准确的修复方式，存在错误DNA连接和变异，敲入效率和精确性较低。使用HDR模板时，细胞将利用其内在的修复机制，与模板同源臂序列进行重组，精确地修复Cas9切割的DNA断裂并实现精确基因敲入，可提高基因敲入效率和精确性，减少修饰误差。

常用HDR模板及优缺点

（1）单链DNA（single-strand DNA, ssDNA）

ssDNA作为CRISPR基因敲入供体模板，由于其具有较简单的核苷酸结构、非特异性整合概率低、细胞毒性较低等特性，可实现准确CRISPR基因敲入，在HDR修复中被广泛使用。

优点：ssDNA在细菌和低等真核细胞中显示出较好重组效率；易于合成和转染到细胞中，且具有较高的HDR效率。ssDNA模板可用于点突变、小片段插入和删除等操作。

缺点：ssDNA插入的长度较短，不适用于大片段DNA的插入。

图2 使用ssDNA作为模板诱导CRISPR-Cas9介导的双链断裂后HDR机制(Deshani et al.,2021)

（2）双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）模板

dsDNA模板通常是通过PCR扩增、合成或从细胞中提取的DNA片段，通常包含目标序列及其周围的同源序列，以提高HDR修复的效率。

优点：dsDNA模板可插入较长的DNA片段，适用于需要大片段DNA插入的基因编辑。

缺点：合成和转染效率较低且其易被细胞中的核酸酶降解。dsDNA易被NHEJ修复途径合并，从而导致同源臂复制或dsDNA模板的部分整合。通过NHEJ同源独立性插入片段可能会发生双链断裂（double-strand break，DSB）脱靶或者产生内源性DSBs。此外，dsDNA模板还存在细胞毒性，线型或质粒dsDNA转染效率较低等短板。

图3 使用长双链DNA模板的CRISPR/Cas9介导的HDR策略(Sachiko et al.,2019)

（3）RNA模板

RNA可作为HDR模板参与 CRISPR/Cpf1介导的DNA同源重组修复。

优点：与DNA模板相比，RNA模板具有易于合成优势。此外，RNA模板可在细胞内产生更高的修复效率，与RNA模板更易地被细胞摄取和转录成DNA，促进了同源重组修复的进程有关。同时RNA模板可避免DNA模板的不良影响（如细胞毒性、不良的基因重排和不必要的基因剪接事件等）。

缺点：由于RNA的易降解性和低稳定性，其在基因敲入中RNA模板的应用仍需进一步研究和优化。

图4 crRNA和RNA DRT的制备示意图(Shaoya et al.,2019)

（4）基因组DNA

基因组DNA同样可作为CRISPR-Cas9介导的同源重组修复模板，用于实现精确的基因编辑。

优点：与其他类型的HDR模板相比，基因组DNA具有多个同源序列和大量的基因组信息，可用于实现较大范围的基因编辑，包括基因敲除、修复、敲入等操作。

缺点：基因组DNA通常较大，不同细胞类型和不同基因组区域的大小也不同，因此不确定性较高，导致使用基因组DNA作为HDR模板时，不同细胞或不同基因组区域的编辑效率和准确性不同。此外，基因组DNA含有大量的序列信息，可能包含多个同源序列或非同源序列，增加基因编辑的难度和不正确重组率；使用基因组DNA作为HDR模板涉及到人类基因组信息时需遵守相关的伦理和法律规定，以确保实验的安全和合法性。

图5 CRISPR效应器(米色齿轮)与重组酶(灰色齿轮)结合，可与基因组等大序列DNA整合(Lei Tang et al.,2022)

在基因编辑技术的CRISPR/Cas体系中，基于同源介导修复 (homology directed repair, HDR) 机制开展的基因敲入是其重要应用之一，合适的HDR模板是决定基因敲入成败与效率的重要因素。

三、CRISPR基因敲入实验流程步骤

（以敲入RFP蛋白为例）

1、构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

（1）确定敲入位点

①若敲入的片段不参与翻译，则在想插入的附近设计sgRNA即可，并且根据sgRNA位置附近的序列设计donor载体（关于donor载体的设计在后文会详细介绍）。

②若敲入的基因参与翻译，并只是想让该蛋白表达蛋白，那么将外源基因插入到基因组中的safe harbor位点则是一个很好的选择。几乎所有的物种相应的针对其safe harbor的研究，人基因组的safe harbor有AAVS1，CCR5，以及ROSA26等。中国仓鼠的safe harbor有site A， T2，以及T9。需要注意的是将基因插到safe harbor处，需要一同准备promoter，enhancer等元件。

③若要敲入的基因参与翻译，并需要与宿主蛋白形成融合蛋白，那么需要考虑外源蛋白与宿主蛋白之间linker的问题，是使用刚性linker（rigid linker）还是柔性linker（rigid linker），还是选择自剪切多肽（2A Peptide），抑或是不使用linker。

（2）设计sgRNA

（设计sgRNA的具体步骤已在敲除篇中详细介绍，本文略）

（3）构建sgRNA-Cas9质粒

将设计好的sgRNA构建到PHB-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体上。

图6 PX459载体图

（4）设计donor质粒

①设计并制作两端同源臂（homologous arm）：截取sgRNA靶点上游1000bp左右的序列，制作左同源臂（HA-L）；截取sgRNA靶点下游1000bp左右的序列，制作右同源臂（HA-R）。

需要注意的是根据敲入位点，donor需要补齐一些序列，如需将RFP序列插入A基因终止密码子后而sgRNA设计的位置在终止密码前10个氨基酸处，那设计donor时需要将这10个氨基酸对应的碱基序列加在左侧同源臂上。此外，donor质粒上sgRNA序列需要进行同义突变，防止重复编辑。

②将需要敲入的基因序列（RFP序列）放置于左右同源臂之间，一起合成克隆于pcDNA3.1载体上。

图7 pcDNA3.1载体图

2、将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转目的细胞

用lipofiter3.0转染试剂将上述两种质粒转染至目的细胞。

3、嘌呤筛选，检测荧光

本例子做的荧光蛋白敲入可以直接根据红色荧光信号进行分选。而其他的基因敲入需要根据gRNA质粒里面的荧光进行筛选或者进行puro抗性筛选，然后通过PCR等手段检测基因是否敲入。

4、PCR检测基因组

为了证实在基因组DNA中敲入RFP，设计靶向RFP上游的5’同源臂和靶向RFP下游的3’同源臂的一对引物。对照PCR产物大小即可知敲入是否成功。

5、单克隆分选

前期工作：准备好96孔板，在96孔板的四周加上300ul的DPBS（含双抗），中间6×10的孔中，加入300ul完全培养基（含双抗）。最后用无菌的parafilm封好四周。

（1）将转染结束的细胞消化下来

（2）500xg离心3min，用PBS重悬

（3）细胞悬液过300目细胞筛，筛出单细胞悬液

（4）加入PBS和培养基的96孔板，以及单细胞悬液一同置于冰上，等待流式分选

（5）上机分选，准备好的60个孔，每个孔分选入1个细胞

（6）分选后仍然将96孔板放在冰上保存

（7）将细胞放回培养箱中培养，5天后换液

（8）等待细胞分裂增殖到超过50%汇合度（一般会需要2周时间）

（9）消化细胞，随后利用孔板离心机离心细胞，弃消化液

（10）加入300 μl完全培养基到每个孔中，平均传到两块96孔板中（150 μl每孔），一块用于传代，一块用于PCR鉴定

（11）通过设计引物，进行PCR，检测基因是否敲除

（12）为进一步验证，将PCR产物送去Sanger测序

6、将敲入正确的多个单克隆进行扩增并冻存

需要注意的是尽可能多留几株不同的单克隆，以免某些单克隆的细胞特征与WT细胞差异过大。（一般文章中会使用3个不同的单克隆）

本期内容针对CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）的实验原理、HDR模板的选择、及实验流程步骤等三大方面进行了详细介绍，希望对CRISPR-Cas9基因敲入系统研究方向的小伙伴可以有所裨益。下期我们将继续为大家介绍CRISPR-Cas9系统在转录调控中的应用，敬请关注！

参考文献：

[1] Murillo-Rodríguez E,Rocha B N,Veras B A, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J].Sleep and Vigilance, 2018,2(1).

[2] Sachiko Okamoto, et al. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Sci Rep 2019, 4811.

[3] Deshani C. Ranawakage, et al. Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Knock-In of Composite Tags in Zebrafish Using Long ssDNA as a Donor. Front Cell Dev Biol 2021,8:598634.

[4] Shaoya Li, et al. Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination. Nature Biotechnology 2019,37,445–450.

[5] Lei Tang, et al. Loading large DNA cargoes. Nature Methods 2023,20,33.8. Jinlin Wang, et al. Efficient targeted insertion of large DNA fragments without DNA donors. Nature Methods. 2022,19,331–340.