举例：③号管对应孔的荧光比例为30%，细胞总数为8×10⁴，滴度（TU/mL）=8×10⁴×30%×10³ /0.1=2.4×10⁸如果要感染2×10⁵个细胞，MOI=30（1个细胞对应30个病毒粒子）（见下注），则需要病毒体积为=2×10⁵×30/2.4×10⁸（mL）=0.025mL=25μL.

注：MOI值:MOI是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。

定量PCR法检测整合到基因组DNA中的病毒序列

可用于不带荧光标记的慢病毒

1. 病毒感染细胞

① 感染前6 h在24孔板中以2.5×10E+5细胞/孔均匀接种HEK293细胞。

② 将慢病毒进行梯度稀释，共做3个梯度，即每孔（500μL无双抗、无血清的DMEM培养基）中含10 μL、1 μL、0.1 μL 病毒，振荡混匀后加至接种好细胞的24孔板。

③ 感染 18-20h后，将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基。

④感染 64-68h 后收集细胞并进行基因组DNA的提取。

2.基因组DNA qPCR检测

① 提取各孔细胞基因组DNA。

② 以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品，慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数。

③ 以Actin质粒梯度稀释为标准品，Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数。

3.计算慢病毒滴度IU/mL

IU/mL=(C×N×D×1000)/V

C：平均每基因组慢病毒整合拷贝数；

D：病毒稀释倍数；

N：感染时细胞数目（2.5×10E+5）；

V：加入稀释病毒的体积。

三、p24蛋白ELSIA试剂盒法测定慢病毒滴度

p24蛋白是慢病毒外壳中含量较高标志性蛋白。p24 ELISA法测量病毒上清液中p24衣壳蛋白的量，然后将p24的含量水平与病毒滴度关联起来。

检测原理：采用固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测样品中的HIV-1 p24抗原。慢病毒样品中HIV-1 p24抗原与固相抗-p24单克隆抗体和生物素标记的抗-p24多克隆抗体通过免疫反应，形成固相抗-p24单克隆抗体—p24抗原—抗-p24多克隆抗体-生物素复合物；然后加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链亲和素，形成固相抗-p24单克隆抗体—p24抗原—抗-p24多克隆抗体-生物素—链亲和素-HRP复合物；加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H₂O₂氧化TMB生成蓝色的产物（更大吸收峰655nm），加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（更大吸收峰450nm）。其吸光度与校准品和样品中的HIV-1 p24抗原浓度成正相关。通过建立标准样品曲线可得出样品中 HIV-1 p24抗原浓度。

其主要步骤为（详细方法参见市售的p24 ELISA试剂盒）：

(1) 样品准备和稀释

(2) 标准曲线样品制备

(3) 样品检测

(4) 检测数据分析

值得注意的是，该方法最终得出的样品中p24蛋白的含量，单位为pg/mL，是物理单位。

要区别于活性单位TU/mL，因此，采用不同方法检测的病毒滴度在病毒感染细胞时根据滴度需要加入的病毒量也有所差异。

四、qRT-PCR试剂盒检测病毒样本中的基因组拷贝数

检测原理：用特异性引物能够对以HIV-1为结构基础的慢病毒样品的RNA基因组的保守序列进行特异性扩增，通过qRT-PCR对产物进行实时监测。用标准品扩增得到的CT值绘制标准曲线，将待测病毒样本反应的CT值带入标准曲线，计算得到病毒样本中的RNA基因组拷贝数，即病毒颗粒数（copies/mL）。

关于qRT-PCR法测定病毒样品中RNA的方法操作步骤详细请参考对应的试剂盒说明书。

慢病毒滴度测定方法总结

慢病毒滴度检测方法

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