腺病毒包装步骤

重组腺病毒载体是基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是 36kb 长的线性双链 DNA，是一种复制缺陷型腺病毒载体系统。具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率可高达 100%；对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

最常用的腺病毒包装体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，再重组到腺病毒的大骨架上。以上两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），其中 E3 基因对病毒的产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达 E1 的细胞系，例如 HEK-293，HEK-293A等

一、腺病毒包装流程：

二、材料与仪器

三、腺病毒包装和纯化

1．质粒构建和扩增

AdMAX系统：构建连接目的基因的pHBAdMAX质粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre质粒并大量抽提，用于转染293A细胞。

AdEasy系统：构建连接目的基因的pHBAdEasy质粒并进行酶切线性化；线性化后转入BJ5183感受态（含pAdEasy-1骨架质粒）进行重组，涂板培养单克隆并扩增，抽提质粒进行PacI酶切验证；验证正确的重组质粒转化Stbl3感受态，得到高纯度的重组质粒并进行PacI酶切线性化，用于转染293A细胞。

2.腺病毒包装

这里是以6cm培养皿为例的质粒参考用量。待293A细胞汇合度达到50%-70%时，备好病毒质粒、37℃预热好的DMEM、室温的转染试剂，按操作步骤进行转染。转染6h后更换新鲜培养基。

3.腺病毒收集

挑取 3-6 个空斑不等，放入1 ml新鲜培养基中过夜，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。（注：病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，可在培养液中加入低熔点琼脂糖，一般在转染后第10 ~ 21天可以在显微镜下看到小的空斑。）

4．腺病毒扩增

将培养基中的病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增，至再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒（P1代），感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增并收集病毒。

5．腺病毒纯化

将病毒从-80℃冰箱取出，室温水浴融化。7000×g 4℃离心10min，弃细胞碎片，收集上清，0.22μm过滤除菌即可用于细胞实验。若用于对腺病毒滴度和纯度要求高的动物实验，则需要采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法进行纯化（方法如下）。

①PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。7000×g 4℃离心上述混合物 20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml密度为1.10 g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，PH8.0），病毒液应呈粉红色。

②CsCl梯度离心：加入2 ml密度为1.40 g/ml的CsCl溶液，然后再缓慢加入3 ml密度为1.30 g/ml的CsCl溶液，再加入5 ml的病毒悬浮液。使用Beckman SW28转子，26,000 rpm，4℃离心2小时。

三种不同密度CsCl溶液的配制:

CsCl梯度离心示意图

③收集病毒：用注射器收集密度在1.30 g/ml和1.40 g/ml之间的病毒条带至透析袋中。（注：透析袋使用前用10 mM EDTA-Na2煮沸10 min，降至室温使用）

④透析：在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl2，定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。

6.病毒重悬和保存

弃上清，500 μl重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 ℃保存，如需长时间存放需置于-80 ℃或液氮罐保存。

注意事项:

1. 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。

2. 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3. 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。

4. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5. 动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2 级别）完成。

6. 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

7. 实验完毕用洗手液清洗双手。