如何设计microRNA引物

microRNA是一类内源性非编码单链RNA，在体内以前体和成熟体的形式存在，而我们对某种的microRNA的表达检测的对象是成熟体，microRNA的成熟体长度约为19-25nt，由于其序列和性质的特殊性，我们需要使用与普通mRNA不同的方法对其进行引物的设计。目前主流的方法有两种：茎环法和加尾法。

下面我们就简单讲一下miRNA的研究方法，可以分为以下几个方面：①miRNA芯片:利用miRNA 芯片，可以高通量分析不同肿瘤样本或者不同组织中miRNA的差异表达，对靶基因进行分析，及发育变化中的作用。②过表达和封闭:通常基因功能研究常常采用过表达、干扰、敲除等方法。研究miRNA的功能也不例外。通过导入化学合成的小分子 miRNA mimics（mirRNA的成熟体），或者构建mirRNA过表达载体，实现过表达特定mirRNA的目的。通过构建抑制miRNA的inhibitor，实现抑制特定mirRNA功能的目的。观察靶基因mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前 miRNA 功能研究的常用方法。③双萤光素酶报告系统:通过生物信息学分析获得miRNA的靶基因及相应的结合位点是功能研究的关键内容。将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR 序列克隆入商品化的双萤光素酶报告载体中，通过检测荧光素酶报告系统发光的强弱，对miRNA以及靶基因结合位点进行体外功能验证。④QPCR 验证：可以用来检测miRNA 以及其靶 mRNA 和相关 mRNA 等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA 设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。

对于miRNA芯片或者miRNA mimics/inhibitor等，一般可以选择从公司购买。对于QPCR 验证，涉及到的主要是miRNA的引物设计，而miRNA的引物设计方法与常规引物设计方法不同。下面就详细讲解一下miRNA的荧光定量PCR引物设计方法-茎环法：

茎环法：

1. 关于microRNA引物设计（茎环法）：

由于microRNA在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物。

需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长microRNA的）+实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物

逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端microRNA特异性序列组成，5’端茎环结构通常固定，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。

3’端特异性序列由与成熟的microRNA3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。

固定的颈环序列（5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’）+microRNA末端6-8个反向互补碱基。

2. 上游引物：包括5’端通用序列和3‘端microRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟microRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟microRNA。

3. 下游通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA -3’ （茎环引物上取，可以挪）这个就更简单了，直接在颈环上摞一段即可，然后计算下gc。

相关链接：

https://www.omicshare.com/forum/thread-775-1-1.html

miRNA的网站：http://www.mirbase.org

引物设计问题软件： http://mirbase.org/

加尾法：

增加microRNA逆转录产物长度最直接的方法就是增加microRNA的长度，即在microRNA的3’后面添加一段序列，然后进行逆转录反应。因此，加尾法是由两个酶共同作用完成的，它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给microRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。其过程如下：

加尾法逆转录引物的结构包含三个关键结构：

①为了与PolyA序列互补配对，Oligo dT序列必不可少。

② 在Oligo dT序列的5'端，存在一段通用序列，用于qPCR过程中反向引物与cDNA的结合。

③ Oligo dT序列的3’端存在一个或两个锚定碱基，V或者VN。(兼并碱基，V代表A、G或C，N代表ATCG中的任意一种)。

如果没有锚定碱基，逆转录引物中的Oligo dT就会随机结合到PolyA的任意位置，这样会造成同一microRNA的逆转录产物长度不一，给最后的熔解曲线检测带来麻烦。因此，锚定碱基的作用就是特异性地结合到microRNA上，从而让逆转录引物结合到紧挨着microRNA的那段PolyA序列上。

只有这样，才能够保证同一microRNA的逆转录产物大小相同。

qPCR

microRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法逆转录产物的5’端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R)，不同的是根据microRNA序列设计的正向引物。正向引物的特异性就变得非常重要。

加尾法的特点

加尾法逆转录的最大特点在于：对于抽提纯化的microRNA，进行无差别加尾。因此，如果用户需要对样本中的多个miRNA进行考察，一次逆转录即可完成对所有qPCR模板的制备。qPCR引物方面，microRNA以及内参的反向引物都是通用引物R，不同的只是正向引物。因此在设计加尾法microRNA的qPCR引物时，只需设计特异性正向引物即可，正向引物的特异性直接决定了实验结果的好坏。总之，加尾法适合对样本中多个microRNA的快速检测。引物设计简单，但有非特异性的风险。由于其特殊的加PolyA机制，因此microRNA加尾法逆转录是无法仅通过常规的mRNA逆转录试剂盒完成的。