IF＞16 | GBM治疗新方法：多功能纳米药物“AG@Cu9S8@dOMV”协同治疗

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，现已成为中国最常见的死亡原因之一。目前除传统的手术、放疗和化疗外，还建立了一系列肿瘤治疗新方法，如生物治疗、免疫治疗、物理治疗(热、光、磁、电、超声)和动力学治疗等，并且研究发现肿瘤协同治疗效果明显优于单种治疗。

浙江省人民医院临床医学研究所牟晓州/蔡宇课题组于2023年6月26日在《Chemical Engineering Journal》（IF：16.744）发表了一篇题为“Camouflaging multifunctional nanoparticles with bacterial outer membrane for augmented chemodynamic/photothermal/starvation/chemo multimodal synergistic therapy of orthotopic glioblastoma”的文章。研究中作者构建了一种无脂多糖细菌外膜囊（lipopolysaccharide-free bacterial outer membrane vesicles, dOMV）纳米治疗平台，整合化学动力疗法（Chemodynamic therapy, CDT）、光热疗法（photothermal therapy, PTT）、饥饿治疗和化疗四种治疗方式，以协同治疗胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）。值得注意的是，本研究使用了汉恒生物提供的携带Luc的慢病毒。

图1 AG@Cu9S8@dOMV穿过血脑屏障到达脑瘤部位的协同治疗机制

让我们一起来看看具体的研究成果吧。

首先，作者以Cu2O为模板，通过原位硫化法制备Cu9S8，，空心Cu9S8的比表面积为42.86 m2/g，具有良好的载药能力，将AQ4N装载到Cu9S8的空腔中，记为A@Cu9S8，利用两亲性的DSPE-PEG2000-COOH分子在Cu9S8表面包裹药物，堵塞孔隙；然后，通过NHS偶联将GOx连接到A@Cu9S8表面，AQ4N/GOx@Cu9S8(记为AG@Cu9S8)上GOx的附着量约为12μg/mg；最后dOMV包被AG@Cu9S8，制得最终产物，记为AG@Cu9S8@dOMV。

图2 AG@Cu9S8@dOMV的制备与表征

接下来，作者在体外对AG@Cu9S8@dOMV进行了各种活性验证。

Gox能介导葡萄糖氧化，随后通过Cu+引起Fenton样反应生成•OH自由基，并且其酶活在45℃～60℃之间随温度的升高而升高，恰好与PTT的应用温度吻合，为光热强化饥饿治疗提供了依据。研究结果表明AG@Cu9S8@dOMV能在高浓度葡萄糖的诱导下导致H2O2的生成和pH的下降，与对照恒温25℃相比，在1064 nm激光(恒温45℃)照射和有葡萄糖的情况下，AG@Cu9S8@dOMV产生了更多的•OH自由基，这说明光热能引起GOx诱导葡萄糖氧化的级联反应，增强CDT的作用。

图3 AG@Cu9S8@dOMV通过光热效应和GOx介导的H2O2增强CDT

随后的研究发现，当pH为7.4（正常生理条件下）时，AQ4N未出现爆发释放，而GOx催化葡萄糖生成葡萄糖酸，降低环境pH至5.0时，AQ4N的释放量迅速提高到59%。所以纳米颗粒的pH响应特性可以防止AQ4N在正常组织中过早释放，从而大大降低全身毒性，提高抗肿瘤疗效。

另外，在激光照射(温度平衡为45℃)下，AQ4N的分子运动速度明显加快，30 min内AQ4N的释放量可达到40.9%，即光热效应能增强药物释放；不仅如此，1064 nm激光照射AG@Cu9S8@dOMV（100µg/mL）溶液，溶液的温度随着激光功率的增加而升高，当功率不变时，即使在较低浓度（25µg/mL）下，溶液的温度也能在10 min内升高到47.4℃，足以杀死肿瘤细胞。

图4 AG@Cu9S8@dOMV的光热性能以及pH和光热对药物释放的促进作用

Gox通过消耗氧气来营造缺氧环境，产生H2O2增加氧化应激，通过荧光检测dOMV在NPs内化中的作用发现，与GOx处理组相比，AG@Cu9S8@dOMV处理组的细胞表现出更强的绿色（氧化应激探针）和红色荧光（缺氧探针），说明dOMV使得AG@Cu9S8@dOMV能够有效被内化到细胞内启动应答。

图5 AG@Cu9S8@dOMV的细胞摄取

AG@Cu9S8@ dOMV主要是为了进入脑部发挥抗肿瘤功效，所以它的血脑屏障穿越能力和细胞毒性也是重要的检测指标。利用Transwell构建体外血脑屏障模型，AG@Cu9S8@ dOMV处理的细胞平均荧光强度(MFI)比对照高约6.67倍，说明dOMV有助于NPs穿透血脑屏障到达肿瘤部位进行治疗。AG@Cu9S8@dOMV作为级联传递系统，被其处理过的细胞活力低至21.3%，NIR-II激光照射后，细胞存活率继续下降到7.1%，凋亡实验也表明AG@Cu9S8@dOMV + 激光照射处理的细胞晚期凋亡率最高，说明AG@Cu9S8@dOMV通过饥饿、化疗、PTT和CDT联合治疗对肿瘤细胞有明显的杀伤效果。

图6 AG@Cu9S8@dOMV的细胞毒性

肿瘤耐热性主要是由于细胞在热刺激下会上调热休克蛋白的表达，抵抗高温对肿瘤细胞的损伤，实验数据也表明42℃或激光处理的细胞中热休克蛋白高表达。但热休克蛋白的表达依赖于ATP的能量供应，AG@Cu9S8@dOMV + 激光照射后细胞ATP水平极显著降低，与此同时，检测到HSP70的相对表达水平显著降低，为对照组的0.44倍。说明激光照射下通过光热效应增强GOx活性，进一步强化葡萄糖的消耗，降低细胞内ATP水平，下调HSP表达，使PTT作用下肿瘤细胞的自我保护机制失效。