萤(荧)光素酶报告基因检测原理

萤（荧）光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。

一、实验原理

荧光素酶报告基因检测的原理‌是通过检测荧光素酶的活性来反映基因表达的情况，将荧光素酶基因与目的基因或其调控元件（如启动子、增强子、3’UTR等）连接在一起，构建成报告基因载体，转染或转化到目标细胞或生物中。当目的基因或其调控元件受到内外因素的影响而发生表达变化时，相应地也会影响荧光素酶基因的表达水平。通过向样品中加入特定的底物，使荧光素酶催化底物氧化发出生物荧光，并利用专用仪器（如发光仪、微孔板读板仪等）检测荧光信号的强度，从而反映目的基因或其调控元件的活性。

荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, fluc)和海肾荧光素酶（renilla luciferase，rluc）可分别催化荧光素(luciferin)和腔肠素（coelenterazine） 产生生物荧光反应,反应过程如下图所示。

二、研究应用

荧光素酶作为一种理想的报告基因，可用于启动子研究、miRNA研究、信号转导通路研究等等。

在报告基因的5'端加上待检测基因的启动子，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，那报告基因的表达量就越大，荧光值越高。如果在报告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用来检测miRNA对于目的基因的调控（抑制作用），报告基因表达越少，说明miRNA的作用就越强。

一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内对照使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值，这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

实验步骤和操作方法：

1.构建荧光素酶报告质粒‌：将感兴趣的基因转录的调控元件克隆在荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。

2.转染细胞‌：将构建好的质粒转染到细胞中。

3.刺激或处理细胞‌：对细胞进行适当的刺激或处理。

4.裂解细胞‌：使用PLB裂解液裂解细胞。

5.测定荧光素酶活性‌：通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，从而判断基因表达情况‌

应用领域和优缺点：

应用领域‌：广泛应用于基因表达调控、启动子活性研究、转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的研究等‌12。

优点‌：非放射性、检测速度快、灵敏度高、适用于高通量筛选‌

缺点‌：需要特定的设备和试剂，操作相对复杂‌

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