IF>39 |乳腺癌肺转移“凶手”——MHCIIhi中性粒细胞

乳腺癌常被称为“粉红杀手”，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位。发生肺转移是乳腺癌患者死亡的重要原因，而乳腺癌肺转移的发生与压力、肥胖、吸烟等多种因素引起的慢性炎症密切相关，同时，肿瘤患者免疫防御能力减弱导致其容易遭受由病原菌引起的慢性肺部感染。因此，研究病原菌引起的慢性炎症与乳腺癌转移的关系是对乳腺癌治疗极其重要的。

2023年8月11日，四川大学华西医院周西坤研究员课题组、四川大学华西口腔医院李敬研究员课题组和中国科学院大学温州研究院吴敏教授课题组共同合作在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF=39.3）发表了题为“Chronic pulmonary bacterial infection facilitates breast cancer lung metastasis by recruiting tumor-promoting MHCIIhi neutrophils”的研究论文，该研究首次证实慢性肺部细菌感染能促进乳腺癌的肺转移进程，并鉴定到一群名为MHCIIhi的中性粒细胞亚群在促进乳腺癌转移的过程中发挥着重要作用，结果表明，MHCIIhi中性粒细胞可能是肺转移的潜在治疗靶点。值得注意的是，本研究中用于构建萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）4T1细胞稳定株（4T1-luc）的慢病毒由汉恒生物提供。

下面我们一起来看看研究结果：

为了评估慢性肺部感染与乳腺癌肺转移之间的关联，作者首先通过原位注射4T1-luc细胞建立小鼠肿瘤模型，随后在成瘤后接受琼脂珠包埋PAO1（铜绿假单胞菌标准菌株）的气管内滴注，与对照组（CTRL组）相比，慢性感染PAO1的小鼠（以下称CI组）死亡率显著增加且肺重明显增高，肺转移结节数量也显著增多，H&E染色显示，CI组小鼠肿瘤负荷更强，但是两组小鼠原位肿瘤的重量和体积并无统计学差异。同样，在MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠模型中，由PAO1引起的慢性肺部感染增加了小鼠的肺重并促进了乳腺癌向肺的转移和定植，而不影响原位肿瘤的重量。

图1. 肺部慢性铜绿假单胞菌感染促进乳腺癌肺转移

接下来，作者检测了CI组和CTRL组小鼠的肺组织中免疫亚群的差异，将两组小鼠的肺细胞进行了质谱流式检测（CyTOF），并生成了包括T细胞、B细胞、NK细胞、骨髓细胞在内的单细胞免疫图谱，结果显示，CI组中所有这些细胞的比例略小于CTRL组。对淋巴细胞的聚类分析结果显示，与CTRL组相比，肺中CI组的CD3+T细胞表达更高水平的PD-1。随后作者又提取了髓系标志物进行聚类分析，在髓系谱系中，与CTRL组相比，除中性粒细胞降低外，M2巨噬细胞的数量和比例显著增加。因此，作者接下来将研究重点放在了中性粒细胞上。

图2. CyTOF分析慢性细菌感染的肺组织中的免疫细胞

中性粒细胞已被证明可以在不同的环境条件下促进或抑制乳腺癌的肺转移。最近有研究表明，中性粒细胞是异质的，但中性粒细胞亚型的类别和功能比其他免疫细胞的研究要少得多。中性粒细胞的聚类分析表明，小鼠肺组织中至少有6个中性粒细胞亚型群，包括：MHCIIhi中性粒细胞、Ly6C 中性粒细胞、CD62Lhi中性粒细胞、 Siglec_Fhi 中性粒细胞、Ly6Clow 中性粒细胞和其他中性粒细胞亚群。作者通过CyTOF分析显示，MHCIIhi中性粒细胞在CI组的肺中的存在比例高于CTRL组，流式细胞术结果表明，肺部慢性感染PAO1促进了MHCIIhi的积累。然后作者分析了MHCIIhi中性粒细胞在模型小鼠肺部的位置，免疫荧光染色显示MHCIIhi中性粒细胞出现在肿瘤结节的外围，患者样本的免疫荧光分析也证实MHCIIhi中性粒细胞分布在肿瘤的外围和内部。这些结果表明，MHCIIhi中性粒细胞可能在乳腺癌向肺部转移中发挥作用。

图3. 乳腺癌小鼠肺组织MHCIIhi中性粒细胞的鉴定

为了进一步了解中性粒细胞亚群的作用，作者探究了MHCIIhi中性粒细胞是否表现出促瘤特性。作者对从慢性感染PAO1的乳腺癌小鼠分离的MHCIIhi中性粒细胞和MHCIIlow中性粒细胞进行了RNA测序，并使用GO和Reactome富集分析差异表达的基因，血管生成相关途径的上调表明，MHCIIhi中性粒细胞可能促进血管生成以支持肿瘤细胞生长，而且许多与肿瘤促进过程相关的基因在MHCIIhi中性粒细胞中高度表达。这些结果表明，MHCIIhi中性粒细胞可能重塑肺部微环境，以促进肿瘤细胞的转移。

为了评估MHCIIhi中性粒细胞与MHCIIlow中性粒细胞的功能，作者通过流式分选从荷瘤小鼠中分离出中性粒细胞，通过Transwell实验表明，MHCIIhi和MHCIIlow中性粒细胞都可以促进肿瘤细胞迁移和侵袭，且MHCIIhi中性粒细胞对肿瘤迁移的影响更大。RNA-seq和流式细胞术结果显示，MHCIIhi和MHCIIlow中性粒细胞都高表达ROS相关基因，而MHCIIhi中性粒细胞比MHCIIlow中性粒细胞产生更多的ROS，然后作者检测发现MHCIIhi比MHCIIlow具有更强的释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的能力。这些发现表明，与MHCIIlow中性粒细胞相比，MHCIIhi中性粒细胞具有直接和间接的促瘤功能。

接下来，作者验证了MHCIIhi中性粒细胞是否在体内表现出促瘤功能。为此，作者从慢性感染了PAO1的乳腺癌小鼠的肺中分离出的MHCIIhi和MHCIIlow中性粒细胞，在4T1细胞接种小鼠后的第11、14、17天将中性粒细胞输送到肺中，第21天处死小鼠，发现与其他组相比，MHCIIhi组的转移性肺结节数量显著增加。

图4. MHCIIhi中性粒细胞在体内和体外均表现出促瘤作用

为了进一步探索MHCIIhi中性粒细胞在肺中聚积的机制，作者分析了未感染和慢性感染细菌小鼠肺组织的转录组数据，发现许多趋化因子在慢性细菌感染的小鼠中高度上调。众所周知，趋化因子CCL2可以招募巨噬细胞，还可以在炎症状态下通过CCL2-CCR2信号通路招募中性粒细胞。所以，作者研究了CCL2是否参与了MHCIIhi中性粒细胞的招募。作者在慢性细菌感染小鼠的肺组织和外周血中检测到CCL2的表达水平升高，而且与MHCIIlow中性粒细胞相比，MHCIIhi中性粒细胞表达更高水平的Ccr2。随后，作者评估了CCL2在体外招募MHCIIhi中性粒细胞的能力，流式细胞荧光分选技术（FACS）结果显示，用CCL2诱导后，MHCIIhi中性粒细胞在总中性粒细胞部分中的比例显著增加。同时，作者探究了CCL2是否在体内招募MHCIIhi中性粒细胞，在荷瘤小鼠模型被细菌慢性感染后，将CCL2中和抗体或IgG滴入肺中，FACS分析评估小鼠肺中MHCIIhi中性粒细胞的比例和数量，结果显示，CCL2中和抗体显著抑制MHCIIhi中性粒细胞向肺的迁移，而且与IgG组相比，CCL2中和抗体组的转移性肺结节数量显著减少。总之，这些结果表明，肺中的慢性细菌感染上调了CCL2的表达，反过来，CCL2可以部分地将MHCIIhi中性粒细胞募集到肺中，以促进癌症的肺转移。

图5. 慢性肺部细菌感染来源的CCL2将MHCIIhi中性粒细胞招募到肺部

综上所述，该研究发现慢性肺部细菌感染可以显著促进乳腺癌的肺转移，其作用机制是慢性炎症升高肺部CCL2的含量，CCL2迁移到外周血中并募集具有促瘤作用的MHCIIhi中性粒细胞至肺组织中，而高聚积的MHCIIhi中性粒细胞促进了乳腺癌向肺部的转移以及肿瘤细胞的定植。相关数据不仅提升了慢性炎症在促瘤作用中的认识，还发现了一群新定义的促瘤中性粒细胞亚群，为中性粒细胞的异质性研究提供了新证据，更可为肿瘤免疫治疗提供新思路及理论依据。

图6. 慢性肺部细菌感染诱导肺转移的机制示意图