Molecular Cancer IF=37.3|中山大学研究团队发现肝癌治疗潜在靶点：CircPIAS1

图1. CircPIAS1在HCC中的表达和特征

2.在体内外实验中下调CircPIAS1可抑制HCC细胞的增殖和迁移

为了探究CircPIAS1在HCC发生发展中的作用，作者在PLC/PRF/5细胞中敲低CircPIAS1的表达，在Huh7细胞中上调CircPIAS1的表达，研究结果显示：下调CircPIAS1的表达，可以抑制PLC/PRF/5细胞的增殖和迁移，过表达CircPIAS1可以促进Huh7细胞的增殖和迁移。在异种移植肿瘤模型中CircPIAS1过表达组肿瘤生长速率和肿瘤重量显著增加；CircPIAS1敲低组肿瘤生长速率和肿瘤重量显著下降。另外，在肺转移模型中， CircPIAS1敲低组肺转移灶面积显著减少。以上实验结果表明：CircPIAS1的高表达在体内和体外均有助于HCC细胞的侵袭性表型。

图2. CircPIAS1在体内体外促进肝癌细胞增殖和迁移

3.CircPIAS1抑制HCC细胞铁死亡

为了探究CircPIAS1促进HCC肿瘤生长的分子机制，作者对CircPIAS1敲低的PLC/PRF/5细胞进行转录组测序，基因富集分析（GSEA）结果显示：当CircPIAS1被敲低时，PLC/PRF/5细胞中的差异表达基因显著富集在氧化还原过程、氧化还原酶活性、脂肪酸代谢过程和NFE2L2.V2途径相关的信号通路，由此提示敲低CircPIAS1可能参与氧化代谢相关的细胞死亡的信号通路。为了确定敲低CircPIAS1诱导的细胞死亡类型，作者使用细胞凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）、细胞坏死抑制剂（Nec-1）以及铁死亡抑制剂（Fer-1和Lipro-1）处理CircPIAS1敲低的PLC/PRF/5细胞，研究结果显示：铁死亡抑制剂能够显著逆转CircPIAS1敲低引起的细胞生长抑制，表明CircPIAS1敲低可能诱导了HCC细胞的铁死亡。在Huh7细胞中过表达CircPIAS1能显著降低Fe2+和脂质ROS（活性氧）的表达水平，并且升高GSH（谷胱甘肽）的水平；反之，敲低CircPIAS1后，PLC/PRF/5细胞中Fe2+和脂质ROS水平显著升高，而GSH水平显著降低。同时，作者检测了铁死亡相关蛋白的表达水平，结果显示：CircPIAS1敲低组细胞中SLC7A11、FTH1和GPX4等铁死亡相关蛋白的表达水平显著降低，而CircPIAS1过表达组细胞中这些蛋白的表达水平显著升高。由此表明CircPIAS1的表达可以抑制HCC细胞的铁死亡。

图3 .CircPIAS1抑制HCC细胞铁死亡

4.NUPR1是CircPIAS1调节铁死亡的下游因子

作者通过对转录组数据分析，发现CircPIAS1敲低后NUPR1（已被证实与铁死亡密切相关）的表达水平下降，表明NUPR1可能是CircPIAS1的下游靶基因。接着，作者在HCC细胞中过表达或敲低CircPIAS1，通过qPCR和WB检测NUPR1的表达水平，结果显示，敲低CircPIAS1能显著抑制NUPR1的表达，反之，过表达CircPIAS1能促进NUPR1的表达。并且，在CircPIAS1敲低的HCC细胞中，细胞内Fe2+和脂质ROS水平上升，GSH水平下降，这种变化可被NUPR1过表达逆转，由此表明NUPR1能抑制由CircPIAS1敲低引起的铁死亡。相反，CircPIAS1过表达会降低Fe2+和脂质ROS水平，提高GSH水平，这种效应会被NUPR1抑制剂ZZW-115所抵消。此外，NUPR1过表达能恢复因CircPIAS1敲低而减弱的肝癌细胞增殖和迁移能力，而ZZW-115则能部分抑制因CircPIAS1过表达而增强的肝癌细胞增殖和迁移。这些实验结果表明CircPIAS1通过调节NUPR1的表达来调节HCC细胞的铁死亡。

图4. CircPIAS1通过NUPR1调节HCC细胞对铁死亡的敏感性

5.CircPIAS1通过ceRNA机制吸附miR-455-3p上调NUPR1的表达

由于CircPIAS1定位于细胞质，由此作者推测CircPIAS1有可能通过ceRNA机制调节NUPR1的表达。作者利用3个数据库（ENCORI、Targetscan和miRDB）预测了与CircPIAS1和NUPR1结合的miRNA，筛选到了miR-455-3p作为候选基因。TCGA数据库显示miR-455-3p在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织，与CircPIAS1的表达相反。接着，作者通过双荧光素酶实验和RIP实验，验证了miR-455-3p与CircPIAS1的结合。并且，在表达水平上，过表达miR-455-3p有效降低了CircPIAS1过表达而引起的NUPR1水平的增加，而抑制miR-455-3p显著抵消了敲低HCC细胞中CircPIAS1表达而引起的NUPR1的表达降低。这些实验结果表明在HCC细胞中CircPIAS1通过其海绵（sponge）效应结合miR-455-3p，进而上调NUPR1的表达。

图5. 在HCC细胞中CircPIAS1通过其海绵效应结合miR-455-3p，进而上调NUPR1的表达

6.CircPIAS1通过吸附miR-455-3p促进HCC细胞的侵袭性表型

为了探讨CircPIAS1的促肿瘤作用是否通过其对miR-455-3p的海绵效应而介导，作者在HCC细胞中进行了挽救实验。研究结果显示CircPIAS1过表达诱导的细胞内Fe2+和脂质ROS的减少和GSH水平的增加可以被miR-455-3p模拟物逆转；相同地，CircPIAS1敲低诱导的细胞内Fe2+和脂质ROS的积累以及GSH水平的降低可以被miR-455-3p抑制剂抵消。此外，研究结果显示：miR-455-3p模拟物能消除由过表达CircPIAS1引起的Huh7细胞增殖和迁移的增加；miR-455-3p抑制剂能逆转由敲低CircPIAS1引起的PLC/PRF/5细胞增殖和迁移的抑制。这些实验数据表明CircPIAS1能通过miR-455-3p的分子海绵促进HCC细胞的侵袭性。

接着，为了探究miR-455-3p在HCC细胞中的功能，作者构建了miR-455-3p稳定过表达和沉默的HCC细胞系，研究结果显示：过表达miR-455-3p显著增强HCC细胞的铁死亡，并且这种现象可以被过表达NUPR1逆转。相反，沉默miR-455-3p显著抑制HCC细胞的铁死亡，这种现象可以被NUPR1抑制剂ZZW-115消除。过表达NUPR1能挽救由过表达miR-455-3p引起的HCC细胞的增殖和迁移的抑制；ZZW-115能逆转由沉默miR-455-3p引起的HCC细胞的增殖和迁移的增加。另外，qPCR和WB实验结果显示过表达miR-455-3p抑制NUPR1的表达，沉默miR-455-3p可以促进NUPR1的表达。以上实验结果表明miR-455-3p确实通过抑制靶基因NUPR1的表达来发挥功能。

图6. miR-455-3p逆转CircPIAS1诱导的HCC细胞铁死亡抑制和侵袭性表型

7.NUPR1通过与FTH1的启动子区域结合来促进FTH1的转录

为了探究NUPR1调节铁死亡相关蛋白的分子机制，作者检测了过表达NUPR1对铁死亡相关蛋白的影响，研究结果显示，过表达NUPR1能促进FTH1的表达，ZZW-115可以抑制FTH1的表达。为了进一步探讨NUPR1调节FTH1的分子机制，作者对FTH1的启动子进行分析，并通过Chip-qPCR和双荧光素酶实验验证了NUPR1与FTH1的启动子结合：NUPR1过表达可以增强FTH1启动子的荧光素酶活性，而ZZW-115可以抑制FTH1启动子的荧光素酶活性。此外，ZZW-115可以抑制CircPIAS1过表达引起的FTH1启动子的荧光素酶活性的增强，而过表达NUPR1可以逆转敲低CircPIAS1引起的FTH1启动子荧光素酶活性的抑制作用。与前面的研究结果一张，敲低CircPIAS1导致FTH1的表达减少可以被过表达NUPR1逆转，过表达CircPIAS1导致FTH1的表达增加可以被ZZW-115消除。此外，公共数据库显示FTH1和NUPR1在HCC组织中的表达均高于癌旁组织，并且FTH1和NUPR1的表达呈正相关。CircPIAS1在癌旁组织中的表达水平和NUPR1、FTH1的表达也呈正相关，此外，NUPR1或FTH1的高表达与HCC患者总生存率降低有关。这些研究结果表明NUPR1通过激活HCC细胞中FTH1的表达抑制铁死亡。

图7. NUPR1通过与FTH1的启动子区域结合来促进FTH1的转录

8.ZZW-115在体内诱导铁死亡，并提高HCC对lenvatinib的敏感性

为了研究抑制NUPR1表达是否可以增加HCC细胞对lenvatinib的敏感性。作者通过体内外单独给与ZZW-115、lenvatinib或ZZW115和lenvatinib联合用药后检测细胞存活率和肿瘤生长。研究结果显示：在细胞水平上，ZZW-115和lenvatinib联合用药对过表达CircPIAS1的HCC细胞的抑制作用比单独使用两种药物更明显；在动物水平上，ZZW-115和lenvatinib的联合用药可以有效抑制肿瘤生长，并降低肿瘤重量，与单独使用药物相比，联合治疗组的肿瘤生长抑制效果最为显著，肿瘤组织坏死区域更大，并且NUPR1和FTH1蛋白表达水平降低。这些研究数据表明ZZW-115和lenvatinib联合用药可能会增强lenvatinib对肝癌的治疗效果。

图8. ZZW-115在体内诱导铁死亡，并提高HCC对lenvatinib的敏感性

综上所述，本研究不仅揭示了CircPIAS1通过miR-455-3p/NUPR1/FTH1调控轴调节HCC细胞的铁死亡进而调控HCC的进展，为HCC的诊断和治疗提供了新的分子标志物和潜在靶点，而且研究发现ZZW-115能够逆转CircPIAS1介导的促癌效应，并增强对现有靶向药lenvatinib的敏感性，为HCC联合治疗策略提供了新思路，具有重要的临床应用前景。

图9. CircPIAS1在HCC中的促癌机制示意图