悬浮细胞怎么转染，如何提高悬浮细胞转染效率

悬浮细胞 是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染有很大的不同。转染过程中，操作步骤一定要谨慎。

操作步骤

1、取一支已灭菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相应体积的300 mM NaCl稀释，用枪头混匀后静置5 min；另取一支已灭菌的Ep管，加入相应体积的300 mM NaCl稀释对应体积的PEI溶液用枪头混匀后静置5 min（稀释液与DNA、PEI的总体积应为转染体积的5%）。

将质粒和PEI溶液混合，枪头混匀后静置一段时间，使DNA与PEI形成稳定的聚合物。

2、从摇床中取出293F细胞。用1 mL移液枪滴缓慢滴加转染混合液，边加边摇晃摇瓶使转染更加充分。

3、转染后将悬浮细胞置于摇床中培养，条件为37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h进行细胞计数并用台盼蓝染色液观察细胞的存活率。

如遇转染效果不佳，以下是一些可实施的方案，以提高悬浮细胞转染效率：

1. 选择正确的转染试剂：悬浮细胞转染受到许多因素的制约，选择适合悬浮细胞转染的试剂是提升效率的关键。建议使用汉恒生物的转染试剂3.0高效转染试剂，高效低毒，适用于普通细胞系和难转染细胞系，如悬浮细胞， 

2. 细胞状态：细胞的生理和生长状态对转染效率也有影响。通常在转染前的24小时，需要换新鲜的培养基，保持细胞在最理想的状态。对于悬浮细胞，转染前必须保证细胞密度在一个合适的范围内，避免过于稀或过于浓。

3. 转染时间和温度：对于典型的悬浮细胞，如淋巴细胞和原代T细胞，最适合的转染时间一般在37°C下进行4-6小时。如果转染时间过长，可能会影响细胞生长，且无法显著提高转染效率。

4. DNA的浓度：使用去内毒素的质粒大提试剂盒，细菌产生的内毒素对细胞状态有很大的影响。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，确保质粒OD值A260/A280在1.8~2.0之间。提完质粒后进行琼脂糖凝胶电泳实验验证DNA的纯度，通常情况下DNA为超螺旋状态（此状态下转染效率更高）。

5. 培养环境：重新悬浮细胞在转染过程中可能经历压力反应，影响转染效率。需确保转染过程中细胞的最佳生长条件，如适合的pH、温度、湿度以及足够的营养。

6. 多次转染: 多次转染可能提高转染效率。但需注意可能对细胞的生存产生负面影响。

7. 病毒介导的转染: 病毒介导的转染法效果通常比非病毒方法更好，例如使用慢病毒或逆转录病毒进行转染，特别是在需要长期表达的情况下。推荐汉恒生物的T细胞专用慢病毒和悬浮细胞专用腺病毒，T细胞专用慢病毒病毒感染具有人鼠细胞特异性还可以构建稳转细胞系；而悬浮细胞专用腺病毒腺病毒的滴度更是高达1011PFU/ml，并且腺病毒的载体容量最高可达8kb。这两款产品都是转染悬浮细胞的不二之选。感染悬浮或半悬浮细胞,需要通过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后,封好口,放入平角离心机后,低速(1200g)离心1h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替,将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心,去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,轻轻吹打混匀5-10下,室温放置15 min(尽量不要超过30 min,间隔10min可以再吹打一次)然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染即可。

转染效率的提高不仅取决于一个单一的因素，而是多个操作步骤中考虑的结果，因此密切关注并调整各个步骤，以找到最佳的转染策略。