分子互作干货4-RIP实验指南及常见问题

在前面几期中，小编为大家介绍了IP、CO-IP和CHIP的原理、实验方法和常见问题，本期我们为大家带来研究RNA与蛋白免疫共沉淀技术——RIP技术的基本概念和实验方法。

近十年来，mRNA的转录、加工、转运、修饰和调控的分子机制，以及非编码RNA与蛋白的互作机制，逐渐成为学术研究中必不可少的一环。无论小到几十bp的miRNA，还是大到几万bp的lncRNA，都会涉及到与蛋白的相互作用。RNA分子可以通过其二级或三级结构与蛋白质相互作用，形成核糖核蛋白复合物(RNPs)，进而发挥一些生物学功能，比如我们熟知的miRNA就是众多蛋白结合形成复合物后，才能发挥基因沉默的功能，而不是以单独的一个miRNA与靶RNA互作。 因此，对于RNA结合蛋白（RNA- binding proteins，RBP）的研究也逐渐成为新的研究热点。RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与RBP结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。利用RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对复合物中的RNA进行分析。

RIP技术原理

RIP的实验原理和CHIP类似，是利用某一蛋白的抗体，将目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以捕获和目标蛋白互作的RNA分子，再对捕获的RNA进行定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来进行鉴定。

RIP实验当前已经衍生出很多方法，可以主要分为两大类，自然沉淀法（Native methods）和交联RNA免疫沉淀（cross-linked RNA immunoprecipitation）。

自然沉淀法，是让RNA和蛋白在生理环境下生成复合物，虽然这种方法能保证正常的生理环境和原有的化合物互作。但它们仍然有一些缺点，首先，RNA和蛋白质复合物在细胞裂解后可以重新解离，因此不能准确地再现体内发生的相互作用。其次，仅能检测与目标蛋白直接结合的RNA及其在免疫沉淀样品中的丰度，不能检测间接结合的RNA。

为了防止细胞裂解后蛋白质和RNA的重新结合，可以使用交联剂来固定相互作用。交联剂分为可逆和不可逆，不可逆的交联剂存在一定局限性不利于后续的实验研究，如紫外交联剂。而可逆的交联剂更有利于相关分子的后续研究，比如甲醛，它还能迅速穿透细胞膜，保持细胞中复合物的天然状态。交联RNA免疫沉淀不仅能仅能检测目标蛋白的结合RNA及其在免疫沉淀样品中的丰度，还能捕获并检测弱结合或间接结合的RNA，能精确定位蛋白质和RNA的直接和间接结合位点。

图1. 自然沉淀法和交联RNA免疫沉淀法对比

伴随着技术手段的不断发展，RIP的应用也得到了拓展，和当前其他热门技术相结合，以探索更多未知的生命过程。

通过RIP获取的RNA可以利用二代测序技术，进行宏观分析。在20世纪90年代，随着基因组学领域的迅速发展，科研人员为了满足更高效、更低成本的测序需求，研发了二代测序技术。这种技术具有更高的通量，同时成本也得到了大幅降低。而在2010年，来自美国霍华德·休斯医院研究院的华裔教授Jeannie T. Lee团队成功地将RNA免疫沉淀(RIP)与高通量测序技术相结合，创新开发了RIP-seq（RNP immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing）技术。该技术的主要思路是通过将RIP与高通量测序技术联合，利用抗体将与目标蛋白质结合的RNA沉淀下来，然后进行富集和纯化，最后利用高通量测序技术对沉淀的RNA进行测序。这种技术的优点在于可以检测到低丰度的RNA，同时能够准确地定量分析RNA的表达水平¹。

最近几年关于m6A相关研究迅速发展，正是得益于meRIP-seq技术的开发及应用。meRIP-seq高通量测序技术的出现，能够高效精确检测全转录组不同的RNA 甲基化，是成功发现RNA 甲基化机理及功能的关键技术。MeRIP-seq 技术采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA 特异性抗体与被随机打断的RNA 片段进行孵育，通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段进行高通量测序，结合生物信息学分析，即可在转录组范围内对发生m6A的RNA进行系统性的研究。

RIP实验方法

RIP可以看成是ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的步骤与ChIP实验会有一些差别。

RIP实验的流程可以简单归纳为：

1.收集细胞；

2.分离并裂解细胞核；

3.剪切片段化染色质；

4.将所研究的 RNA 结合蛋白 (RBP) 和结合的 RNA进行免疫沉淀；

5.洗涤、纯化免疫沉淀后 RBP 上结合的 RNA；；

6.将 RNA 逆转录为 cDNA，通过 qPCR、微阵列或测序进行分析。

具体实验操作如下2：

1.制备细胞裂解液（自然沉淀法）

a)收集细胞（汇合度约80-90%）；

b)细胞计数，每2-5mg的总蛋白对应5-20*10^6个细胞，取细胞量参考使用的试剂盒；

c)离心收集细胞；

d)PBS洗涤细胞后离心收集细胞沉淀重复2次；

e)加入裂解液裂解细胞；

f)保存在-80℃备用。

2.磁珠和抗体制备（自然沉淀法）

a)重悬protein A/G磁珠，磁珠加入到离心管中，使用NT-2 buffer洗涤两次；

b)使用NT-2 buffer重悬磁珠后加入目的蛋白抗体或阴性对照；

c)室温孵育使抗体和磁珠结后，离心后将离心管置于磁架后去除上清；

d)使用NT-2 buffer反复洗涤后，加入NT-2 buffer重悬放置冰中备用。

3.蛋白RNA复合物免疫沉淀（自然沉淀法）

a)取细胞裂解液置于新的离心管中，加抗体并标记“input”；

b)在摇床上孵育3h以上或者4℃孵育过夜；

c)孵育后，将离心管置于冰浴的磁力架上孵育1分钟后弃去上清；

d)使用免疫沉淀缓冲液洗涤5次。

4.制备细胞裂解液（交联法）

a)收集细胞（汇合度约80-90%）；

b)细胞计数，每2-5mg的总蛋白对应5-20*10^6个细胞，取细胞量参考使用的试剂盒；

c)向细胞悬液中加入甲醛，甲醛终浓度为1%,室温孵育10分钟；

d)加入十分之一体积的2.66 M甘氨酸，室温孵育5分钟，冰上孵育10分，终止止交联反应；

e)PBS洗涤细胞后离心收集细胞沉淀重复2次；

f)将细胞重悬于裂解液中，置于冰水孵育；

g)使用Dounce杵打释放细胞核；

h)超声破碎DNA；

i)加入DNA酶降解DNA；

j)加入EDTA终止DNA酶反应；

k)保存在-80℃备用。

5.磁珠和抗体制备（交联法）

a)重悬protein A/G磁珠，磁珠加入到离心管中，使用洗涤缓冲液（1 % Triton X-100, 0.1 % sodium deoxycholate,0.01 % SDS, and 140 mM NaCl）洗涤两次后重悬；

b)加入抗体；

c)室温下旋转孵育1小时，使抗体与包被珠结合，离心后将离心管置于磁架后去除上清，并使用洗涤缓冲液反复洗涤6次； 

d)洗涤后，使用洗涤缓冲液重悬置于冰上备用。

6.蛋白RNA复合物免疫沉淀（交联法）

a)取细胞裂解液置于新的离心管中，加抗体并标记“input”；

b)在摇床上孵育3h以上或者4℃孵育过夜；

c)孵育后，将离心管置于冰浴的磁力架上孵育1分钟后弃去上清；

d)使用低温的免疫沉淀缓冲液洗涤5次

7.RNA纯化（自然沉淀法/交联法）

a)使用带有蛋白酶K的缓冲液重悬“input”管内免疫沉淀，55 ℃孵育30分钟；

b)将离心管置于磁力架上，将上清转移到新的离心管中；

c)上清液每管加入苯酚:氯仿:异戊醇(125:24:1)溶液，强力涡旋15秒后，离心分离液相；

d)小心吸取最上面一层的水相，不要吸走蛋白质界面。将其放入新管中，加入氯仿。涡流管15s，在室温下离心10分钟，分离液相；

e)吸取水相，加入乙醇溶液（ammonium acetate 5 M, 15 μl of LiCl 7.5 M, 5 μl glycogen (5 mg/ml)）；

f)在-80℃下保存1小时至过夜，使RNA沉淀，随后离心30分钟，弃上清；

g)使用80%的乙醇洗涤沉淀；

h)离心，弃上清，晾干沉淀；

i)加入DEPC水溶解RNA沉淀；

j)加入DNA酶进一步清除DNA杂质。

8.将 RNA 逆转录为 cDNA

a)根据制造商的说明，使用逆转录 DNA 酶处理 RNA，逆转录为cDNA后备用。

9.对cDNA样本进行qPCR、微阵列或测序进行分析

常见问题及解决方法

1.无法沉淀目标蛋白

可能原因：抗体选择和使用过程存在问题

解决方案：

（1）IP或者WB测试抗体可以与目标RBP结合

（2）另选一个能与抗原其他表位结合的抗体

（3）更换其他品牌抗体

（4）检查抗体保存，稀释，孵育等使用过程是否存在问题

2.蛋白酶k消化不完全

可能原因：蛋白酶K失活

解决方案：确保水浴温度应在55℃左右，长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。

3.提取RNA后，A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因?

(1)需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。

(2)RNA可能降解，操作过程中避免RNA酶污染。

参考文献：

(1)Zhao, J.; Ohsumi, T. K.; Kung, J. T.; Ogawa, Y.; Grau, D. J.; Sarma, K.; Song, J. J.; Kingston, R. E.; Borowsky, M.; Lee, J. T. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Molecular cell 2010, 40, 939-953.

(2)Gagliardi, M.; Matarazzo, M. R. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2016, 1480, 73-86.

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