免疫沉淀技术之染色质免疫共沉淀（ChIP）

上一期我们介绍了免疫沉淀技术中用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的免疫共沉淀技术（co-IP），然而可以与蛋白质相互作用的不只有蛋白质，还有DNA和RNA等。本期将重点介绍蛋白质与DNA相互作用的研究方法----染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunopreci pitation，ChIP），ChIP技术是一种用于表观遗传学研究的技术，可以快速反映蛋白质-DNA相互作用。这一期我们主要从ChIP实验的原理、实验流程和注意事项几个方面来详细介绍和分析ChIP实验，供大家参考学习。

一、什么是ChIP？

作为一种研究蛋白质与DNA相互作用的技术，ChIP可以完整真实地反映细胞中特定蛋白与DNA的结合关系，它通过多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质-DNA提取）、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA样本回收，将蛋白-DNA复合物分离出来进一步研究特定的结合蛋白或与其结合的DNA，同时结合qPCR（ChIP-qPCR）可用于检测已知蛋白与特定结合位点的DNA是否结合以及结合的强度，结合二代测序（ChIP-seq）可用于分析目标蛋白在全基因组内的结合情况，用于下游基因的发掘。

二、ChIP实验的原理是什么？

ChIP的基本原理与Co-IP类似，即用DNA结合蛋白的抗体去沉淀得到蛋白-DNA复合物。简单讲，使用甲醛或其他交联剂将活细胞固定，以保留细胞内的蛋白-DNA复合物，随后采用超声或核酸酶将DNA随机切断成一定长度的小片段，接着用特定蛋白抗体结合并富集蛋白-DNA片段复合物，最后将复合物纯化、解交联后检测得到的DNA片段。

三、什么时候会用到ChIP?

（1）转录因子

利用ChIP检测特定的转录因子在基因组中的结合位置及序列，可发现下游基因的顺式调控元件，从而帮助完善转录因子参与的信号通路。

（2）转录机制

ChIP可用于检测RNA聚合酶II以及其他转录组分的结合位点，从而发现启动子和增强子的序列，同时也可能发现新的转录调控机制。

（3）组蛋白特异性修饰位点

ChIP研究在组蛋白密码的发现和表征方面起着关键的作用，通过ChIP可发现组蛋白特异性修饰的水平，同时也可明确组蛋白的修饰对基因的调控作用。

四、ChIP一般实验流程

由于不同公司的ChIP实验试剂盒操作细节不同，根据所使用的试剂盒进行实验操作即可，这里整理的一般实验过程，方便大家对整体实验步骤了解。

ChIP实验流程和分析方法^[1]

1.交联

首先取适量细胞，胰酶消化后加入含 1% 甲醛的 Extraction Buffer 中，37℃孵育15-30min。交联完成后，加入 2ml 2M 甘氨酸，使其终浓度为 0.125M，混匀后继续等待5min，终止交联反应。最后吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次，离心5 min收集细胞。

ChIP检测首先需要将蛋白质-DNA复合物固定，这一步骤对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析，通常采用1%甲醛交联，固定时间需要注意，时间过长会导致染色质难以切断且得不到合适的长度，时间过短可能会导致固定不足；之后可以加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。

2.裂解阶段

从细胞或组织中提取交联蛋白-DNA复合物，让它们进入溶液。在这个阶段，通过去污剂溶液溶解细胞膜，从而释放细胞组分。由于蛋白质和DNA的相互作用主要发生在核内，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。去污剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA复合物，因为在第一步中实现的共价交联将在整个ChIP过程中保持复合物的稳定性。不建议对细胞进行机械裂解，因为这会导致效率不高的核裂解。

接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。

注意：此时可以停止ChIP测定，将裂解物于-80℃储存。

3.染色质片段化

提取步骤产生所有核材料，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白-DNA复合物。为了分析蛋白质结合序列，提取的基因组DNA必须被剪切成更小的可行片段。DNA裂解通常是通过机械的超声波或微球菌核酸酶（MNase）消化来实现的。

细胞核材料片段化是获得良好的ChIP分辨率的关键因素，理想的染色质片段范围在200到1000bp之间；然而，DNA剪切是最难控制的步骤之一。超声波提供真正随机的片段，但局限性包括可能需要协调一致的专用设备、超声波过程中难以保持温度、延长的实际操作时间和更多的优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有高度的可重复性，更适合于处理多个样品，但由于酶活性的变化和酶对核小体间区域具有更高的亲和力，该消化过程可能导致变异。

注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80℃储存。避免反复冻融。

4.免疫沉淀

将目的蛋白的特异性抗体固定在磁珠上，与蛋白－DNA复合物在4℃摇床孵育过夜，离心去上清后得到蛋白－DNA复合物；然后用洗涤缓冲液洗涤沉淀物三次，每次洗涤后需离心去上清。

选择合适的抗体是ChIP实验成功的关键步骤。多克隆抗体具有识别多个表位的优点，但是其批次差异较大并且来源有限；重组单克隆抗体几乎消除了批次之间的差异并且来源广泛，但它们可以识别的蛋白质构象有限。如果针对某些靶标没有可用的抗体，则可以使样品表达与亲和标签（HA、Myc、His等）融合的蛋白质，然后使用针对亲和标签的抗体进行免疫沉淀。

5.DNA回收和纯化

首先洗脱DNA-蛋白质复合物，并释放DNA：可采用各类Washingbuffer进行一次快速5min洗涤，最后加250μLElutionbuffer，65℃水浴15min，洗脱后吸取上清。将上清中以及Input加入20μL5MNaCl，65℃水浴，解交联6h以上。解交联后，可以在室温下进行DNA的回收和纯化，然后对回收的DNA进行浓度测定。

为了获得更纯的DNA样品，建议使用RNaseA进行处理。从剩余的蛋白质中纯化DNA时，应使用苯酚:氯仿提取或离心柱进行DNA纯化。

注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20℃储存。

6.分析检测

纯化得到的DNA通过ChIP-qPCR定量测定其水平，也可以通过ChIP-seq进行分析。

五、ChIP实验注意事项

ChIP实验操作看相对简单，但是实验耗时长，通常需要至少一周的时间完成一次实验，过程繁琐，每一步都很考验实验操作技术，所以看似简单的实验其实需要注意的事项很多。工欲善其事，必先利其器，下面我们一起来看下具体有哪些值得注意的问题吧。

1.注意设置对照组

（1）InputDNA组：超声使染色质断裂后，得到未进行IP且经解交联的DNA。InputDNA是检查ChIP实验效率的参照，所以InputDNA对照是必须要设置的。

（2）阴性对照组：一般将IgG设置为阴性对照，即在ChIP样本中加入IgG抗体。

（3）阳性对照组：阳性对照一般使用已知与DNA序列结合且保守的蛋白抗体，例如H3组蛋白抗体或RNApolII抗体。

2.交联时间和交联剂的选择

不同实验条件和细胞类型，进行甲醛交联的时间和交联剂类型都不同，通常需要摸索优化。根据经验，一般使用1%的甲醛浓度进行交联，室温固定10-15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与DNA的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致ChIP结果不理想。

体内交联传统上是用甲醛实现的，但可以与其他交联剂如EGS和DSG结合使用。甲醛交联是两种直接相互作用的分子的理想选择。然而，甲醛是一种零长度的交联剂，限制了其功能性。对于更高阶相互作用，较长的交联剂如EGS(16.1Å)或DSG(7.7Å)可以捕获具有复杂四元结构的较大蛋白质复合物。研究人员经常使用交联剂的组合来捕获蛋白质-DNA相互作用。这些交联剂直接渗透到完整的细胞中，有效地将蛋白质-DNA复合物锁在一起，即使是短暂的相互作用复合物也能被捕获并稳定下来进行分析。

3.细胞方面

（1）ChIP实验所用细胞数量过多，将直接导致甲醛交联时间增加，切断染色质的过程中易造成裂解的DNA片段超过1000bp，这些片段极易丢失，进而导致实验失败。最佳的DNA片段长度是200bp-1000bp。相反，如果过细胞数量太少，切断的DNA片段极可能小于100bp，或样本量不足。实验细胞用量多少合适，最好进行预实验摸索。

（2）不同类型的细胞有不同严格程度的裂解要求，可在显微镜下比较样品前后变化，检查细胞裂解的效率。

（3）保持细胞状态良好，避免更多的因素影响细胞中蛋白与染色质的结合。

4.目标蛋白抗体

（1）ChIP实验首选用ChIP级抗体，是实验成功的关键因素。ChIP级抗体识别的蛋白表位与WB和一般IP实验是有区别的，并且能够耐受高盐、低盐及多种去垢剂的洗涤。如果目标蛋白没有对应特异性抗体可用，除了定制抗体外，还可以给目标蛋白融合标签，通过标签蛋白检测目标蛋白。

（2）抗体浓度做梯度测试，实现最佳的信噪比。

5.ChIP超声时注意事项有哪些？

（1）超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且应将脉冲限制在30秒以内，保证低温，以避免蛋白质因过热而变性。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生气泡。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。不同细胞超声条件不同，首次操作需根据样品细胞系优化片段化条件。

（2）若超声时出现泡沫，立即停止超声，至于冰上。之后用冷冻离心机高速离心1分钟去除泡沫，继续超声。还可以通过降低超声功率来防止起泡。

6.ChIP-qPCR引物设计

ChIP-qPCR实验一般瞄准的是基因的启动子区域，这一部分相对于基因翻译区，信息要模糊的多，可以通过NCBI上的gene browser来辅助分析，一般可以在转录起始位点（TSS）上游100~1000bp选择，同时需要至少设计两对引物，从中选择效果较好的。

以上即是本期的主要内容，从实验原理、一般实验流程和注意事项几个方面来详细介绍ChIP实验，希望能对大家的实验有帮助。下期将继续介绍免疫沉淀相关的技术—RIP，感兴趣的小伙伴可以关注下~汉恒专注病毒包装十余载，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！

参考文献：

[1]CollasP.Thecurrentstateofchromatinimmunoprecipitation.MolBiotechnol.2010May;45(1):87-100.doi:10.1007/s12033-009-9239-8.