Nat Met丨AAV助力肝脏脂代谢领域新进展！

近几十年来，肝脂肪变性的全球患病率和发病率一直在上升，尤其是在中国和西方国家。肝脂肪变性是最常见的慢性肝脏疾病之一，通常与肥胖和胰岛素抵抗（IR）有关。肝脂肪变性的发病机制复杂，尚未完全阐明，但IR被认为是其发展的主要致病因素。在生理条件下，胰岛素可以抑制肝脏糖异生，促进肝脏脂肪的从头合成（DNL）以储存热量。在IR期间，胰岛素不能抑制肝脏葡萄糖的产生，肝脏DNL仍无限制地增加，胰岛素水平与肝脏脂质沉积之间存在正相关关系，但肝脏脂肪变性增加的机制尚不完全清楚。

2023年9月21日，山东第一医科大学附属省立医院赵家军教授团队在《Nature Metabolism 》在线发表题为“Upregulation of WDR6 drives hepatic de novo lipogenesis in insulin resistance in mice”的研究论文，该研究发现WD40重复序列的蛋白6（WDR6）在IR期间促进肝脏DNL。人WDR6蛋白是含有WD40重复序列（WDR）的蛋白，WD40重复序列是一个保守的蛋白质结构域，由40-60个氨基酸残基组成，它的基本功能是协调多种蛋白质复合物的组装，含有这种重复序列的蛋白质广泛分布在各种组织中。在本文中，作者发现WDR6在高脂饮食（HFD）诱导的IR期间上调，随后通过上调参与肝脏DNL的关键代谢酶——脂肪酸合成酶（FASN）促进肝脏DNL，作者还发现了一种天然小分子—XLIX，可以阻断WDR6的相关作用，从而减少IR期间的肝脏脂肪变性。总之，这些结果指出了WDR6 在IR状态下DNL升高过程中发挥的作用，并揭示了缓解脂肪肝疾病的潜在治疗途径。值得注意的是，本研究使用的特异性敲低小鼠肝脏WDR6的腺相关病毒（AAV2/8-TBG-shWDR6）来自汉恒生物。

接下来，我们一起看看研究结果：

首先，作者通过HFD建立IR小鼠模型，然后注射胰岛素，发现在HFD小鼠中FASN随着胰岛素的注入而升高，表明胰岛素在IR过程中仍然可以驱动该脂肪生成基因的表达。为了确定在IR状态下仍然对胰岛素有反应的基因，研究人员进行了肝脏转录组分析，通过分析差异表达基因结合RT-PCR，最终选择WDR6进行进一步的研究。在注射胰岛素或饥饿后重新喂食的情况下，WDR6蛋白水平均增加，此外，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠肝脏中也观察到WDR6蛋白表达增加，这支持了WDR6参与肝脏脂质代谢的假设。

为了验证WDR6是否有助于IR诱导的肝脏代谢紊乱，作者使用了肝脏特异性的AAV病毒（AAV2/8-TBG-shWDR6）敲低小鼠肝脏WDR6的表达，注射后4周再喂食8周的HFD，通过超声分析、油红O染色、透射电镜等的分析发现，WDR6敲低小鼠的代谢紊乱以及肝脂质沉积得到改善，此外，作者用CRISPR-Cas9技术构建的WDR6敲除小鼠也得到了同样的验证结果。为了明确敲低肝脏WDR6是否可以改善HFD的不良反应，作者开发了一种治疗模型，即将AAV-shWDR6注射到已经喂食2周HFD的小鼠中，与注射对照病毒（AAV-shNC）的小鼠相比，shWDR6组HFD诱导的IR和肝脏脂质沉积减轻。综上所述，肝脏特异性抑制 WDR6可改善或逆转IR期间的代谢紊乱，尤其是肝脂沉积。

图1. 在HFD诱导的胰岛素IR期间，WDR6的肝脏特异性敲低可有效阻止肝脏脂质沉积

随后，作者分别对正常饮食组和HFD喂养组的shWDR6和shNC小鼠的肝脏进行脂质组学分析，以深入了解可能受WDR6影响的脂质代谢途径。发现组间差异最大的代谢产物是甘油三酯（TAG），因此，研究人员进一步评估了shWDR6和shNC小鼠中参与肝脏TAG代谢主要途径的各种代表性基因的表达模式，包括DNL、脂肪分解、游离脂肪酸氧化和摄取以及葡萄糖代谢的代表性基因，结果发现HFD组中shWDR6小鼠的DNL相关基因—Fasn在mRNA和蛋白质水平上均低于shNC小鼠，FASN酶活性也较低，而各组间葡萄糖代谢基因的转录没有明显差异。结合同位素分析新合成的棕榈酸（FASN的产物）的含量降低，表明WDR6在IR过程中促进肝脏DNL，而Fasn可能是主要靶点。为了确定WDR6介导的Fasn表达调控是否依赖于DNL的关键转录因子SREBP1c，作者在SREBP1c-KO小鼠的背景上过表达WDR6，尽管SREBP1c缺失可以减少TAG沉积，但WDR6过表达仍然可以增强SREBP1c-KO小鼠的肝脏TAG和FASN蛋白水平。这些结果表明，SREBP1c对于WDR6介导的Fasn表达和肝脏TAG沉积的调节作用不是必需的。

图2. 肝脏WDR6通过调节脂肪从头合成影响甘油三酯沉积

接下来，作者继续探索了WDR6调控Fasn表达的机制。作者对WDR6全身敲除的小鼠（WDR6-WKO）和WT小鼠的原代肝细胞进行转录组学分析，结果提示WDR6可能参与FASN翻译后调控过程。然后作者用免疫沉淀（IP）结合质谱确定了WDR6与PPP1CB结合，随后对WDR6-WKO和WT小鼠的原代肝细胞进行磷酸化蛋白组学分析发现，PPP1CB的第316位苏氨酸（Thr316）的磷酸化在WDR6-WKO的肝细胞中增加。接着，作者研究了磷酸化PPP1CB（Thr316）是否受到WDR6的影响，作者检测了WDR6肝脏特异性敲入小鼠（WDR6-LKI）和WDR6肝脏特异性敲除小鼠（WDR6-LKO）中PPP1CB的磷酸化水平，发现WDR6-LKI小鼠中较低，而WDR6-LKO中较高，同时测试了PPP1CB的磷酸化对外源性/内源性胰岛素的反应，他们发现，与对照组相比，HFD诱导的IR小鼠的PPP1CB磷酸化水平较低，此外，与正常喂养相比，禁食16小时后PPP1CB磷酸化水平升高并在重新喂养6h后急剧下降，上述处理中FASN水平与PPP1CB磷酸化水平显示出相反的变化。这些结果表明，PPP1CB（Thr316）磷酸化水平受WDR6、胰岛素和外部营养环境的影响。

图3. WDR6与PPP1CB相互作用并促进PPP1CB在Thr316位点的去磷酸化

为了阐明PPP1CB在肝脏DNL中的生理功能，作者先用si-PPP1CB或PPP1CB-FLAG过表达载体转染HepG1细胞，发现FASN水平与PPP1CB呈负相关。然后，作者构建了PPP1CB的突变型过表达载体，其中Thr316被丙氨酸（PPP1CB-Thr316Ala）或天冬氨酸 （PPP1CB-Thr316Asp）取代，以分别模拟蛋白质的去磷酸化和磷酸化，发现PPP1CB去磷酸化后 FASN 水平升高，相反，PPP1CB磷酸化后 FASN 水平降低，随后，作者在小鼠肝脏中过表达PPP1CB-Thr316Asp并结合WB实验检测，结果表明，WDR6通过降低PPP1CB（Thr316）磷酸化水平，并在上游刺激因子1（USF1）的介导下促进Fasn基因的转录和脂肪酸的合成。

图4. WDR6 通过促进 PPP1CB 的去磷酸化来调节 FASN 转录

为了探索WDR6与PPP1CB相互作用的机制，作者使用了AlphaFold蛋白质结构数据库预测WDR6蛋白质的结构，然后基于预测的结果设计了一系列WDR6的截短体，IP实验表明，WDR6通过结合基序“FKSRSR”与PPP1CB结合。综上所述，WDR6介导的调节肝脏DNL通过其与PPP1CB的相互作用发生，以促进PPP1CB在Thr316位点的去磷酸化。

图5. WDR6通过FKSRSR基序与PPP1CB 相互作用

接下来，作者将研究结果扩展到了人类样本，检测了来自山东省立医院接受肝切除手术的肝胆肿瘤患者的20份肝组织样本的WDR6和FASN的蛋白质水平以及肝脏TAG含量，发现肝脏WDR6蛋白水平与肝脏TAG或FASN水平呈正相关，提示WDR6可能是肝脂肪变性的潜在治疗靶点，随后作者通过分子对接筛选出绞股蓝中的一个小分子化合物—XLIX可以与WDR6结合，并通过分子动力学模拟分析发现XLIX可以抑制WDR6与PPP1CB结合，然后作者在NAFLD模型和NASH（非酒精性脂肪性肝炎）模型中检测了XLIX的治疗效果。在NAFLD模型中，用XLIX治疗4周后（40mg/kg/天，腹腔注射），发现与对照组相比，XLIX治疗组的血脂和胰岛素敏感性有所改善，肝脂沉积和TAG水平降低，磷酸化PPP1CB增加，FASN水平降低，在NASH模型小鼠中也得到同样的验证结果，另外，NASH模型小鼠中促炎基因以及促纤维化基因的表达也有所减少。最后，作者在WDR6-LKI小鼠中进行XLIX处理，发现肝脏特异性过表达 WDR6减弱了XLIX减少肝脂积累的能力。总之，这些结果表明，XLIX通过抑制WDR6与PPP1CB结合以增加PPP1CB磷酸化的方式改善肝脂沉积并缓解疾病进展。

图6.WDR6可能是肝脂肪变性的潜在治疗靶点

综上所述，本研究发现了未报道过的肝脏DNL关键调节因子—WDR6，在胰岛素抵抗期间，肝脏WDR6上调，并通过促进PPP1CB的去磷酸化来上调FASN的表达最终促进肝脏DNL。更有科学价值的是，研究人员从中药绞股蓝中筛选并鉴定了抑制WDR6与PPP1CB结合的天然小分子—XLIX，可以有效改善胰岛素抵抗引起的肝脂沉积并缓解疾病进展，为NAFLD的预防和治疗提供了新的潜在干预靶点和治疗策略。