原代培养和传代培养

从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，可使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种技术就是细胞培养（cell culture）。细胞培养有时也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。细胞培养的工作始于20世纪初，目前广泛应用于生物学、医学的各个领域，是各种细胞工程技术的重要基础。

根据细胞的来源我们可以将其分为原代细胞与细胞系，他们的获取与持续培养包括原代培养和传代培养，今天就来给大家介绍原代细胞与细胞系是怎样进行培养的。

一、原代细胞与细胞系

原代细胞（primary culture cell）指的是从机体取出后立即培养的细胞。一般把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，此外在当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究面也至关重要。因其最接近和最能反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究，所以在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。

细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体，也指可长期连续传代的培养细胞。(由此便引申出了后来的有限细胞系(Finite CellLine)、无限细胞系(Infinite CellLine))，因此，细胞系狭义上是指可连续传代的细胞(特定环境下口语和书面语都使用)，广义上是指可传代的细胞。1951年从海瑞塔·拉克斯的宫颈癌组织分离的细胞--Hela细胞是历史最久、应用最广泛的细胞系。

二、原代培养与传代培养

1.原代培养

原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，也是一项基本技术。在原代培养中，将动物机体的各种组织取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基和环境下培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。因此，严格说来是，原代培养是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，我们通常把第一代至第十代以内的细胞培养统称为原代细胞培养。

最常用的原代培养有组织块培养、消化培养法、分散细胞培养和器官培养法。

注：此处的原代培养试剂是指初代培养，即原代细胞在传代成功前的培养

① 组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

② 消化培养法

此法进行原代细胞培养时，首先需要将组织样本取出，去除其中血管和结缔组织，然后将其切成小块。接着将组织块放入酶消化液中，进行消化。消化时间的长短取决于组织的种类和大小，一般需要在37℃下进行1-2小时。消化结束后，将消化液离心，去除上清液，留下细胞沉淀。细胞沉淀可以用细胞培养基进行洗涤，去除残留的酶消化液和细胞碎片。最后将细胞沉淀转移到培养皿中，加入适量的细胞培养基，放入培养箱中进行培养

③ 悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

④器官培养

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。

2.传代培养

体外培养的原代细胞或细胞系要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，此即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

依据细胞生长的特点，传代方法有3种：

①悬浮生长细胞传代（离心法）

将悬浮细胞离心（1000 rpm， 3 min）去上清，收集沉淀物加新培养基，混匀后进行传代培养。

②半悬浮生长细胞传代（直接吹打法）

此类细胞（如Hela细胞）部分贴壁，但黏贴不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁上脱落下来，进行传代。

③ 贴壁生长细胞传代（酶消化法）

去除培养容器内培养液后，加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液覆盖整个瓶底为准）37℃静置2-10min（显微镜下动态监测）。移去蛋白酶液，加入培养液反复吹打瓶壁细胞，离心将细胞沉淀用培养液制成细胞悬液。吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于含有适量新鲜培养液的新培养瓶中进行传代培养。

注：细胞接种数要达到5×104~8×105个/ml，传代密度太低时，细胞容易死亡，在达到增殖期前有较长的滞留期；培养液由pH下降而呈黄色时，细胞已达最大密度而需要换液或传代；单层贴壁细胞，等长满培养瓶表面时，即可传代；吹打细胞时，动作要轻柔缓慢，减少对细胞的机械损伤；传代时细胞接种数量要多；培养基的pH要低些；首次传代时，小牛血清浓度可加大至15%~20%。

通过上面介绍我们发现原代细胞培养其实可以分为出初代培养（获得原代细胞）和传代培养（延续原代细胞）两部分，那如何获得原代细胞呢，接下来我们以新生大鼠原代心肌细胞和人PBMC细胞为例分别介绍贴壁细胞和悬浮细胞的初代培养：

1.新生大鼠原代心肌细胞制备

1960年，haray等首次对乳鼠心肌细胞进行培养，体外培养的心肌细胞在生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。

1.手持大鼠乳鼠（出生1-3d），以75%乙醇消毒皮肤，沿胸骨打开胸部，用弯镊提取心脏，至于盛有PBS的100mm大皿中；

注：新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。

2. 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml离心管中充分剪碎成肉泥状；

3.加入3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10mim

注：胰蛋白酶胶原酶混合使用（0.4%胶原酶：0.05%胰酶=2:1）。组织细胞由红转半透明时，停止消化

4.取上清，3000rpm 离心5min，铺中皿含10%胎牛血清的DMEM培养基，剩余沉淀中加入3ml胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶，充分吹匀后37℃继续消化5min；

5.重复4的步骤直至组织块消化完毕；

6.培养箱2-3h待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有中皿上清移入离心管3000rpm离心5min，弃上清，加入10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu，铺中皿培养。

注：溴脱氧尿苷（brdU）可干扰优势分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。

7.48h换液后可得心肌细胞。

人 PBMC 细胞制备

1. 取一15 ml 离心管，加入 2 ml 已用抗凝剂处理过的人血液样品，再加入等体积的 PBS进行稀释（终体积 4 ml）。

注：若为经过处理的浓缩血液样品，请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率，请使用新鲜血液，血液样品请于 18-20℃保存。

2. 上下颠倒或用枪混匀样品，备用。

3. 上下翻转确保 Ficoll-Paque PLUS (GE)分离液彻底混匀，去掉聚丙烯瓶盖，使用注射器针头插入瓶塞吸取 3 ml 分离液。

注：分离之前请将 Ficoll-Paque PLUS 分离液温预至 18-20℃。

4. 取一新的无菌 15 ml 离心管，加入 3 ml 步骤 3 中取出的分离液。

5. 小心加入稀释好的 4 ml 血液样品，不要打破 Ficoll-Paque PLUS 液面。

注：可将离心管倾斜至与水平台面呈 30°，缓慢沿管壁加入血液样品。

6. 将离心管小心竖直放入离心机内，于 18-20℃， 400g 离心 30-40 min。

注：特别注意将离心机的降速加速度调到 0。

7. 小心取出离心管。此时液体分为 3 层：中层为分离液层， 最下层为红细胞，最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为单个核细胞层，小心吸走血浆层，不要打动白膜层。

注：可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用。

8. 用无菌移液枪将白膜层吸到一新的离心管中。

9. 用三倍体积（约 6 ml） 的无菌 PBS 重悬步骤 8 中的 PBMC，重悬时用枪轻柔吹散，于18-20℃， 400g 离心 10-15 min， 重复一次，最后用培养基重悬备用，多余的 PBMC 可以冻存继续使用。

特注：在较高的离心速度下（400-500g）可以提高 PBMC 的得率，同时需注意在较低的离心速度下（60-100g）可以分离掉不需要的血小板。另外，如上操作和比例适用于更大体积的分离。