如何养好细胞之贴壁细胞VS悬浮细胞

上一期讲到的原代细胞和传代细胞的培养，本期将分享贴壁细胞和悬浮细胞的复苏、传代、冻存等操作步骤和技术要点，为您的细胞“健康成长”保驾护航。

根据细胞在瓶、皿等容器中，是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。活体体内的细胞离体后在体外培养大多数以贴壁的方式生长，主要包括一些正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞及肿瘤细胞等。贴壁细胞在体外培养中，形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。少数离体细胞在体外培养时则是悬浮生长，主要包括一些取自血、脾脏或骨髓等的细胞。

复苏篇

冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。一般采用快速融化原则复苏细胞，以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

操作步骤：

1.从液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，放入37℃水浴锅中解冻，并不时摇动（注意管口处高于水面，以免水进入导致污染），整个过程最好在1min以内；

2.将冻存细胞加入到含有5-10ml完全培养基的15ml离心管中，上下吹打数次，使冻存液与完全培养基充分混匀（若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中）；

3.800-1000 rpm离心2-3min；

4.弃上清，用完全培养基重悬细胞，并进行活细胞计数；

5.细胞接种于培养瓶或培养皿中，接种浓度10^6 /ml，置37 ℃细胞培养箱中静置培养，定时观察细胞培养情况（贴壁细胞复苏24h，若密度达到80%，则正常传代；若密度不到80%则继续培养到48小时再换液；悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液。）。

图1. 细胞复苏操作示意图

传代篇

一、 贴壁细胞传代操作步骤

1.用移液管或者巴氏吸管吸取培养液；

2.使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞1-2次；

3.弃PBS，加入胰蛋白酶-EDTA消化液（消化液浓度根据各细胞不同有调整），轻轻摇晃培养瓶，使胰酶与细胞表面充分接触，37 ℃孵育2-3 min，加入含血清完全培养基终止消化。

4.将细胞悬液移入离心管中，800 rpm-1000rpm离心5min，弃上清，加入预热的完全培养基重悬细胞，轻轻吸打混匀，吹打过程中尽量不要出现气泡。

5.细胞计数，根据细胞量选择合适的传代比例，最后转移置37 ℃细胞培养箱中进行培养。

二、 悬浮细胞传代操作步骤

悬浮细胞由于本身在生长培养基中悬浮，无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞损伤较小。悬浮细胞传代，通常有两种方法，直接传代法和离心传代法。

（1）直接传代法

①　悬浮细胞长满至80%-90%左右（细胞悬液变黄，最大细胞密度随细胞系不同而有所差异），即可传代；

②　用吸管吸弃细胞悬液1/2～2/3；

③　加入适量的新鲜培养基，继续培养。

（2）离心传代法

①　将细胞悬液转移到离心管内；

②　800 rpm-1000rpm离心5min，弃上清；

③　使用新鲜的培养基重悬细胞；

④　吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。

表1. 贴壁细胞与悬浮细胞培养比较

冻存篇

细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。细胞冻存一般采用慢冻原则，慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因为产生大的冰晶而收到损害。

一、原理

当温度低至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎全部停止，低于-130℃时，细胞能达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。

冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1.预热冻存液；

2.用PBS冲洗细胞，加入胰酶消化（此步骤同细胞传代操作）；

3.终止消化后，重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5min；

4.弃上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5.分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

6.将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

7.将冻存管转移至液氮长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1.用移液管将细胞悬液吹吸均匀，将细胞悬液移入离心管；

2.1000rpm离心 3 min，收集细胞沉淀；

3.用预热的冻存液重悬细胞，细胞冻存最佳密度为3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；

4.分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

5.将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

6.将冻存管转移至液氮长期保存。

图2. 贴壁细胞冻存操作示意图

注意事项

①　细胞培养、传代以及冻存需要严格的无菌操作。

②　传代时需要适度的消化，消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

③　传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。

④　细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中。

⑤　应选择汇合度80%-90%左右，并且活力达90%以上处于对数生长期时的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整。

⑥　程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂都要复温至室温备用。

⑦　冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。

⑧　冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

⑨　细胞不可长期保存在-80℃冰箱中，放置时间不要超过3天。

⑩　液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。

以上是小恒为大家总结的贴壁细胞和悬浮细胞的培养步骤及要点，希望能给大家提供帮助。

最近收到不少小伙伴的反馈：THP-1和RAW264.7细胞不好养，培养时出现了各种问题，下游实验进行不下去了。下面小恒总结了一份THP-1和RAW264.7细胞培养的攻略，希望能够帮助大家攻克THP-1和RAW264.7细胞培养的疑难杂症。

THP-1细胞

1.THP-1细胞基本信息

THP-1细胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系，又名人单核细胞白血病细胞，悬浮圆形生长。它来源于一位急性单核细胞白血病患者的血液，是人外周血的单核细胞系，可受PMA、TPA诱导向单核系方向分化，是各领域研究常用的细胞系之一。

培养条件：1640+10%FBS+0.05mM β-mercaptoethanol+1% P/S

培养环境：空气，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

冻存条件：50%RPMI-1640+40%FBS+10%DMSO

冻存细胞密度：2×10^6-3×10^6/ml为宜

传代比例：1:3-1:6，每2-3天换液一次

图3. THP-1细胞生长形态图

2.THP-1细胞培养注意事项

①　偏好酸性环境：在偏酸性环境中，THP-1生长更快，当培养基稍微变黄（呈橘红色）时，是适合细胞生长的，此时补液或半换液即可。开启后的RPMI 1640培养基，建议一周内使用完毕。

②　密度依赖性：密度低时，生长较慢，培养密度维持在4×10^5-8×10^5/ml为宜；超过1×10^6/ml则需要传代。

③　THP-1细胞悬浮圆形生长，偶有小聚团，属于正常现象，无需吹散。当贴壁细胞比例高于20%，说明细胞生长环境有异常，这时候就需要排查培养箱温度及CO2浓度、培养基成分，以及培养器皿是否异常。

④　THP-1复苏后恢复较慢，需要3-5天恢复状态；其生长需要稳定环境，不频繁拿出培养箱，不频繁离心，如无特殊情况，复苏后48小时内不对细胞进行操作。

⑤　THP-1细胞对机械力较敏感。正常培养时，应尽量避免吹打力道过大。暴力吹打会使细胞分化和死细胞增加。

⑥　培养时瓶子竖立放置（瓶盖朝上），可增加细胞局部密度，促进细胞增殖。

⑦　β-巯基乙醇可以消除活性氧自由基，维持细胞高密度生长。若培养基中不添加β-巯基乙醇，长期培养细胞可能会出现大量贴壁，严重聚团等情况。当细胞密度过大但需要维持时，可适当增加巯基乙醇的比例（不超过标准量的1.5倍）。

⑧　对血清要求高，血清质量差异可能引起细胞状态变化，建议选用高质量的胎牛血清。

RAW264.7细胞

1. RAW264.7细胞基本信息

RAW264.7又名小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系，为圆形或椭圆形，小而透亮，贴壁牢固。来源于雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤，是常用的炎症细胞模型之一，常见于研究细胞吞噬、细胞免疫、分子免疫学。

RAW264.7细胞具有较强的吞噬能力，在吞噬抗原后，细胞会释放出趋化因子，促使分化，细胞伸出伪足，攀爬能力增强。在细胞培养过程中，细胞吞噬抗原过多、培养条件恶劣或传代后细胞稀疏等情况，都会使细胞呈现出梭形、长梭形的形态，消化难度增加。

培养条件：DMEM+10%FBS+1% P/S

培养环境：空气，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

冻存条件：55% DMEM+40% FBS+5% DMSO

传代比例：1:2-1:4传代，每1-2天换液一次

图4. RAW264.7细胞生长形态图

2.RAW264.7细胞培养注意事项

①　RAW 264.7分裂活跃，培养时注意观察细胞形态，当发生细胞由圆形或椭圆形变为四角形，或伸出伪足等情况时，说明细胞状态改变，需及时传代。

②　细胞传代时不需要用胰酶消化。采用细胞刮传代或吹打传代，刮下来的细胞，收集离心后重悬接种到新的培养瓶中（当细胞密度达到80%~90%的时候，最容易吹下）。

③　培养时，无法保证100% 不分化，若需控制细胞的分化，RAW264.7使用吹打传代，能更好地控制细胞分化率。

④　吹打时力度一定要轻，切勿暴力吹打，只需接种比较容易吹打下来的圆形细胞，不需要强制性全部吹下来，梭形细胞或分化细胞贴壁较牢可直接舍弃。

⑤　RAW264.7对空间十分敏感，复苏密度太高，细胞增殖太快，加剧细胞营养缺失，加速细胞老化。

⑥　脂质体转染效率较低，建议用慢病毒感染。