IF>10 | Setdb1：肝脂肪变性中的潜在靶点

据统计，每年有近1000万人受到酒精性肝病（ALD）的影响，其治疗费用每年超过1000亿美元，给社会带来了巨大的压力。ALD的发展一般是从单纯的肝脂肪变性到脂肪性肝炎，再到肝硬化，最终部分发展为肝癌。酒精性肝脂肪变性是ALD中最早的病理改变标志，在早期有效地预防肝脂肪变性的发生有助于阻止ALD的进展。目前对酒精性肝脂肪变性的发病机制已经做了大量的研究，但准确有效的早期预警和诊断方法仍有待探索。

2023年7月7日，哈尔滨医科大学王志刚教授团队在《Metabolism: clinical and experimental》（IF=13.934）发表了题为：“Alcoholic Setdb1 suppression promotes hepatosteatosis in mice by strengthening Plin2”的研究论文，研究人员发现肝脏中的Setdb1在酒精饲养的小鼠中表达下调，作者用肝特异性敲除Setdb1的小鼠来阐明Setdb1抑制在酒精性脂肪肝中的具体作用和潜在机制。研究结果表明，抑制Setdb1会提高Plin2 mRNA的表达和维持Plin2蛋白的稳定性，这在酒精性肝脂肪变性的进展中起着重要作用，靶向肝脏Setdb1可能是ALD的一种有前途的诊断或治疗策略。值得注意的是，本研究使用的Setdb1过表达腺病毒和Setdb1过表达质粒以及敲低质粒均来自于汉恒生物。

下面我们一起来看具体的研究结果：

首先，作者在GEO数据库中发现H3K9me3甲基转移酶Setdb1在酒精性肝病模型中显著降低，为了证实这种差异性改变，作者相继构建了两种酒精饮食小鼠模型（Lieber-De Carli 模型和NIAAA模型），在这两种模型中，Setdb1的mRNA和蛋白质水平明显降低，Setdb1的表达和H3K9me3的含量在原代肝细胞中也下调，在NIAAA小鼠模型中观察到血清和肝脏甘油三酯水平的显著增加。HE染色和形态学检查显示，与对照组相比，酒精饮食小鼠的肝脏中有严重的脂质积聚。

图1. 慢性饮酒降低小鼠肝脏Setdb1的表达和活性

为了研究Setdb1是否参与了肝脂肪变性的发病机制，作者用siRNA抑制小鼠肝细胞系-AML12细胞中Setdb1的表达。采用Bodipy、油红O染色和电镜技术检测AML12细胞中的脂质积聚情况，结果表明，在Setdb1敲低72小时后，脂滴的数量和大小均显著增加，细胞内甘油三酯和胆固醇的含量也显著提高。而Setdb1的过表达显著抑制了AML12细胞中脂滴的产生并降低了甘油三酯和胆固醇的含量。这些结果表明，Setdb1对肝脏脂质积累具有负调控作用。

图2. Setdb1的敲低增加AML12细胞中性脂质含量

为了进一步确定肝脏Setdb1在体内ALD发病机制中的作用，作者构建了Setdb1肝脏特异性敲除的小鼠（Setdb1-HKO），HE染色等结果显示，Setdb1-HKO小鼠的肝脏中有显著的脂肪积聚，这些结果表明Setdb1缺乏会促进小鼠的肝脏脂肪变性。为了进一步研究Setdb1对肝脏脂肪变性的调节及其对酒精性肝病的保护作用，作者通过尾静脉注射Setdb1过表达腺病毒，发现过表达Setdb1可以改善Setdb1-HKO和酒精饮食小鼠的肝脂肪变性。在两次递送Setdb1过表达腺病毒4周后，在两种酒精饮食小鼠模型中，Setdb1的表达量和由Setdb1缺乏诱导的脂质积聚被逆转。这些结果表明，Setdb1在酒精性饮食诱导的肝脂肪变性的发病机制中起着重要作用。

图3. setdb1过表达腺病毒可减轻Setdb1-HKO小鼠和酒精喂养小鼠的肝脏脂肪变性

为了研究Setdb1对肝脂肪变性保护作用的潜在机制，作者通过分析siSetdb1处理的AML12细胞RNA测序数据来寻找与脂质代谢相关的差异表达基因，发现脂滴相关蛋白Plin2在siSetdb1处理后，mRNA和蛋白的表达均增加，而Setdb1过表达显著降低了Plin2的蛋白水平。此外，两种酒精小鼠模型和Setdb1 HKO小鼠的肝脏中Plin2 mRNA和蛋白质水平与对照相比显著上调。将Setdb1 siRNA和Plin2 siRNA共转染到细胞中，发现抑制Plin2表达后显著减少了Setdb1敲低诱导的脂质积累。总之，上述结果表明Plin2介导由Setdb1抑制引起的AML12细胞中的脂质堆积。同时，作者还通过ChIP-seq发现，Plin2的上游2kb序列具有显著的H3K9me3富集，作者将该区域分为4个片段，ChIP-qPCR结果显示，与IgG组相比，H3K9me3修饰的DNA序列在Plin2上游2kb序列的四个片段中显著富集，而敲低Setdb1则显著降低了片段2和片段4中的富集程度。综上所述，抑制Setdb1通过减轻Plin2 DNA上游序列中H3K9me3修饰来促进Plin2的转录。

图4. Plin2介导由Setdb1抑制引起的AML12细胞中的脂质堆积

有研究发现AMPK的磷酸化影响Plin2的磷酸化，从而引发分子伴侣介导的自噬（CMA），而Plin2相关的CMA在调节肝脏中脂滴的积聚中又起着重要作用。为了研究过表达Setdb1是否调节AMPK磷酸化并引发CMA从而导致Plin2表达下降，作者做了以下实验。通过RNAseq发现AMPK磷酸化相关基因大部分是由Setdb1调节的，作者认为，AMPK磷酸化可以促进Hsc70识别Plin2，这个异二聚体会被运输到溶酶体并与Lamp2a结合，随之被降解。为了验证这个观点，作者通过WB检测AMPK、p-AMPK等基因在Setdb1过表达的AML12细胞、腺病毒过表达Setdb1的Setdb1-HKO小鼠和酒精饮食小鼠中的表达，发现p-AMPK和Lamp2a显著升高，而Plin2显著降低，同时，在Setdb1-HKO小鼠和酒精饮食的小鼠中，肝脏中的p-AMPK和Lamp2a显著降低而Plin2显著升高。为了进一步研究Setdb1如何影响Plin2-Hsp70-Lamp2a CMA复合物的形成，作者进行了Co-IP实验，结果表明，Setdb1过表达促进了Plin2-Hsc70-Lamp2a CMA复合物的形成，从而导致Plin2的降解，而敲低则相反。所有结果表明Setdb1通过影响Plin2磷酸化招募的CMA从而调节Plin2蛋白的稳定性。

图5. Setdb1通过CMA负调控Plin2蛋白的稳定性

作者随后研究了Setdb1在ALD中的下调机制。考虑到miRNA在ALD发展中的重要作用，作者集中研究了GEO数据库中的ALD小鼠模型miRNA芯片，分析得到了两种miRNA：miR-216b-5p和miR-3474，这两种miRNA在两种ALD模型小鼠的肝脏中都显著上调，miR-216b-5p的模拟物能显著抑制Setdb1的表达并促进Plin2的表达，抑制CMA相关蛋白的表达，而miR-3474则没有这种作用。双荧光素酶实验结果表明，miR-216b-5p能结合Setdb1并抑制Setdb1的表达，而miR-3474则没有。Bodipy和油红染色结果显示，miR-216b-5p显著增强了AML12细胞中的脂肪沉积，Setdb1过表达显著则改善了这种情况。这些数据表明，miR-216b-5p通过抑制Setdb1和增强Plin2促进肝细胞中的脂肪积累。

图6. 酒精诱导的miR216b-5p有助于酒精喂养小鼠肝脏Setdb1下调

综上所述，文章表明，Setdb1是酒精性脂肪肝形成和发展的关键表观遗传学分子。Setdb1对肝脂肪变性的影响，可以一部分解释为抑制Setdb1能增强肝脏Plin2的表达和抑制Plin2捕获的CMA以及随后脂滴中的脂质降解从而影响酒精性肝病的进展过程。然而，研究关于Setdb1对脂质代谢的影响仍在进行中，其潜在机制也需要进一步探索，以准确地为肝脂肪变性提供更多的诊断和治疗方式。

图7. 图文摘要