荧光素酶干货系列二： 应用篇-miRNA与靶基因互作研究

上期为大家介绍了萤光素酶的发展和原理。萤光素酶作为一种理想的报告基因，常用于研究miRNA与靶基因的靶向互作、转录因子和启动子调控机制等。本期就来详细聊聊双萤光素酶在miRNA与靶基因靶向互作方面的应用。

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，一个miRNA可以靶向几个不同基因进行调节，同时几个miRNAs也可以调节同一个基因。miRNA可以与编码基因mRNA的3’UTR结合来抑制mRNA的表达，也可以直接与circRNA或lncRNA结合来调控相关基因的表达。

miRNA通常是通过其种子区（seed region），即5’端2-8位碱基与目的RNA靶位点完全匹配结合（注：RNA之间存在U-G结合的模式），并在沉默复合体（miRNA-induced silencing complex）的共同作用下导致目的RNA降解，进而致使目的RNA的表达量下调。基于这个原理，miRNA-target 双萤光素酶报告基因系统被科研工作者普遍认可，用于验证miRNA与靶基因的直接靶向关系。

汉恒生物所使用的萤光素酶报告基因载体psi-CHECK2采用了萤火虫/海肾双萤光素酶双报告基因系统，其中海肾萤光素酶为检测报告基因，而萤火虫萤光素酶则作为内参报告基因。验证miRNA与mRNA/lncRNA/circRNA的互作，将要研究的靶点序列（序列可以是mRNA的3’UTR，也可以是lncRNA/circRNA序列）插入到报告载体中，作为海肾双萤光素酶的3’UTR，与miRNA的mimics共同转染细胞，最后使用酶标仪检测。

图1 pisCHECK2结构图

图2 miRNA与靶基因互作双萤光素酶系统原理示意图

步骤详解

01数字列表结合位点预测

使用Targetscan、Starbase等网站预测结合位点。

02合成miRNA mimics

使用Mirbase网站查询获得miRNA成熟体序列，合成miRNA mimics。

03扩增目的片段

04载体构建

05转染组别设置

第1、2组可说明miRNA与靶基因是否存在结合，第3、4组则可说明突变序列是否是miRNA与靶基因的结合位点。每组设置3个平行。同时设置空白对照，即不转染质粒和miRNA mimics，只有细胞样本和转染试剂的空白组。

注：若预测出多个结合位点且需要明确具体是哪个结合位点发挥作用，则要将多个结合位点分别突变，构建突变型重组表达载体psiCHECK2-mut1、psiCHECK2-mut2、psiCHECK2-mut3……以此类推，分别与miRNA NC、miRNA mimics转染细胞进行双萤光素酶验证实验。我们以三个突变质粒来设置分组如下：

06结果分析

（1）去除背景值：使用酶标仪检测空白组作为blank组，可能会检测出极低的数值，该数值为背景值，需要去除。

（2）数据归一化：将同一样品的去除背景值后的海肾萤光素酶数值（R）除以去除背景后的萤火虫萤光素酶数值（F）。

（3）数据分析：归一化的数据取平均值作图。相比携带野生型质粒和miRNA NC的阴性对照组，携带野生型质粒和miRNA mimic的实验组的相对萤光素酶活性显著下降，即R/F比值减小，而携带突变型质粒的两组实验组相对萤光素酶活性无显著变化。

案例分析

重庆医科大学廖正步教授发现损伤脑组织中circIgfbp2显著升高，敲低circIgfbp2可减轻TBI（创伤性脑损伤）小鼠的焦虑和睡眠障碍。先前有研究表明hsa-miR-370-3p与抑郁症相关，通过生信分析得出circIgfbp2与hsa-miR-370-3p有3个潜在的结合位点。因此，作者将circIgfbp2野生型和突变型构建到psiCHECK2载体上，与hsa-miR-370-3p mimics 共转染HT22细胞进行双萤光素酶验证，结果显示circIgfbp2可与hsa-miR-370-3p结合。最终作者证明circIgfbp2通过吸附hsa-miR-370-3p调控BACH1导致线粒体功能障碍和突触功能障碍，表示circIgfbp2可能成为治疗TBI后焦虑和睡眠障碍的新靶点。

图3.circIgfbp2与hsa-miR-370-3p双萤光素酶验证实验结果

山西医科大学宋静教授构建了煤尘颗粒致大鼠肺纤维化模型，提取外泌体鉴定出4个差异表达的miRNA，miRNA-21p-5p为其中之一，利用生信分析得出Smad7是miRNA-21p-5p的潜在靶基因，接着使用双萤光素酶实验验证，结果显示两者存在互作，因此作者推测miRNA 21-5p /Smad7可能参与了煤尘颗粒诱导的肺纤维化，为煤工尘field的发病机制提供了新的思路。

图4.Smad7与miRNA-21p-5p双萤光素酶验证实验结果

本期主要介绍了miRNA与靶基因互作研究的原理、实验操作，并附上了两篇案例文献，希望对从事相关研究的小伙伴有所帮助。下期我们将介绍双萤光素酶系统在转录因子和启动子调控机制方面的应用，感兴趣的小伙伴可以留意一下哦~

参考文献

[1] Mengran D,Chenrui W,Renqiang Y, et al. A novel circular RNA, circIgfbp2, links neural plasticity and anxiety through targeting mitochondrial dysfunction and oxidative stress-induced synapse dysfunction after traumatic brain injury.[J]. Molecular psychiatry,2022,27(11).

[2] Jing S,Mengtong X,Tiantian W, et al. Exosomal miRNAs contribute to coal dust particle-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2023,249.