荧光素酶干货系列一

在上一系列的干货分享中，我们介绍了组织（细胞）特异性基因表达调控相关知识。接下来，我们将目光聚焦 “检测工具的核心成员”——荧光素酶，开启一个新的篇章。本系列将由荧光素酶的历史和发展开始，详细介绍当前荧光素酶相关实验的干货知识。

荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够催化生物发光的酶的统称，荧光素酶催化的发光也是自然界最常见的生物发光形式之一，人类对荧光素和荧光素酶观察和研究有着悠久的历史。伴随着人类文明的发展，对发光生物认识也从简单的观察记录转为实验性的探索利用。

公元前4世纪的先哲亚里士多德最早提及生物发光，17世纪罗伯特.波义耳则证明了生物发光需要氧气的参与。19世纪 Raphaël Dubois通过实验发现了催化生物发光的重要物质——荧光素酶和它的底物——荧光素。

随着时间的推移，研究人员揭示了更多荧光素酶催化-荧光素发光反应背后的机制。也开始利用这个机制用于科研。

荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素的氧化过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，可通过荧光测定设备测定反应中释放的生物荧光。

目前，以北美萤火虫（Photinus pyralis）来源的荧光素酶（Fluc）应用的最为广泛，应用于分子生物学和生物分析系统，Fluc具有信号强，背景干扰弱，蛋白稳定耐热性强，无需表达后修饰等特点，此外，其底物也无毒且十分稳定，非常适用于体内或者体外实验。

Fluc是腺苷酸形成酶(adenylate-forming enzymes)超家族的一员，其利用ATP的化学能催化荧光素发生氧化、脱羧反应，并伴有发光的现象。Fluc会选择含有羟基-苯并噻唑-噻唑-羧酸结构（hydroxy- benzothiazolyl- thiazoline-carboxylic acid structure ，D-LH2）的底物，并在ATP、氧气和金属离子（如Mg+2）的参与下，D-LH2噻唑啉环上的羧酸盐攻击ATP的α-磷酸基，发生SN2亲核位移反应，生成一种不稳定的荧光素二氧乙酮（luciferin dioxetanone），随后分解生成二氧化碳和一个处在电子激发态的氧化荧光素酶，当电子衰减到基态附近时，释放红色和绿色的光子，光谱的可见区在540 - 600nm之间。

除此之外，Fluc还能催化一些脂肪酸辅酶A形成，甚至有研究通过点突变一种甲虫的脂肪酸酶CoA合成酶，使其转变为荧光素酶，这些证据足以说明Fluc起源于脂肪酸CoA合成酶。

Fluc也是腺苷酸形成酶超家族中第一个通过X光进行结构分析的成员。Fluc的C端和N端的结构域均含有柔性铰链的α+β结构（α+β structure），荧光素的催化活性位点位于近N端的柔性铰链区。通过对其结构的认识，人类对其进行改造，使其广泛应用于不同的检测技术中。

另外，取自海洋腔肠动物海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶（Rluc）也是一种可以催化底物发生荧光反应的单亚基特异活性蛋白。与Fluc不同的是，他们的底物和辅因子不同，Fluc需要氧气、ATP和镁离子同时存在才能催化底物荧光素发光，而Rluc仅需要氧气便可催化底物腔肠素（coelenterazine）发光。区别于Fluc产生的黄绿色荧光，Rluc产生蓝色的光，波长480nm附近。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双信号报告实验中得到广泛的应用。

同Fluc一样，Rluc在完成转录翻译后即具有催化活性。荧光素酶可以作为报告基因，通过检测荧光的强度，来反映荧光素酶的表达水平，进而反映某一表达系统的活力水平。

荧光素酶的具体应用，主要有以下几个方面：

01验证miRNA与mRNA/lncRNA/circRNA的互作

将要研究的靶点序列（序列可以是mRNA上的，也可以是lncRNA/circRNA的序列）插入到报告载体中，作为荧光素酶基因的3’UTR，与miRNA共同转染工具细胞，如果mir与靶序列互作，则荧光素酶表达量下降（检测的荧光信号下降）。

02启动子与转录因子作用分析

将要研究的启动子序列构建到报告载体中作为荧光素酶的启动子，同时转染要研究的转录因子过表达质粒（根据实验需求也可以不转染，利用细胞内源转录因子）。如果转录因子与启动子存在相互作用，则荧光素酶表达量会发生相应改变（检测的荧光信号随之变化）。

03检测信号通路活性

将待研究的信号通路响应元件序列构建到报告基因载体中，相应信号通路激活/抑制后会作用于响应元件，引起荧光素酶表达水平的改变，通过检测荧光信号的改变来反应信号通路的活性。

04动物试验指示作用

将携带荧光素酶的病毒递送载体或稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞注射到实验动物体内后，在不处死动物的情况下，通过注射荧光素酶底物，通过活体成像技术可以观察病毒感染的组织和肿瘤细胞的转移情况。

接下来的几期内容我们将陆续对荧光素酶在科研中的应用进行深入详细的介绍，欢迎大家继续关注我们的内容。