IF=17.694 | LAPTM5或成为非酒精性脂肪肝炎患者的救星

非酒精性脂肪肝炎（NASH）是发展为肝硬化和肝癌的主要原因，其病理特征是肝脂肪性病变、肝细胞气球样变、肝小叶和肝脏炎症以及间质纤维化。目前，预防和治疗NASH的有效措施仍然有限，还没有相应的治疗药物，因此寻找NASH的分子靶点也越来越受到重视。近年来，许多研究证明溶酶体调节着许多疾病的发生发展。其中溶酶体相关跨膜蛋白5（LAPTM5）是LAPTM家族成员之一，可作为一些疾病的干预靶点，例如通过调节MAPK信号通路的活性来改善心肌肥大。此外，MAPK信号通路的激活与NASH发生发展有着密切的关系。因此，作者综合已有研究提出假设，即LAPTM5参与调控NASH的发生发展。

2023年5月8日，华中科技大学同济医学院夏家红教授团队在《nature communication》（IF=17.694）上发表了题为《Lysosomal-associated protein transmembrane 5 ameliorates non-alcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of CDC42 in mice》的研究论文，本研究发现LAPTM5的表达水平与NASH呈负相关，这是由于NASH中高表达的NEDD4L介导LAPTM5泛素化降解。重要的是，作者阐明了LAPTM5对肝细胞的保护作用及其相关机制，为LAPTM5作为治疗NASH的靶点提供了有力的依据。值得注意的是，作者使用了汉恒生物提供的腺病毒载体，成功在小鼠肝脏以及小鼠原代肝细胞中过表达LAPTM5，助力作者阐明LAPTM5抑制NASH发展的机制研究。

下面我们一起来看看作者是如何挖掘其中的机制：

一 、LAPTM5 在脂肪肝中表达下调并与 NASH进展相关

科学研究已发现有大量蛋白质参与调节NASH。为了解NASH发病机制中最关键的蛋白质，作者从NASH患者的肝脏样本中搜索了10个RNA-seq临床数据库，最终发现NASH严重程度与溶酶体相关蛋白表达的关系最为密切（图1 a-d）。另外，5个小鼠肝脏RNA-seq数据库的检索结果也证实了这一结论（图1 e）。作者对上述鉴定出的71种溶酶体跨膜蛋白进行了高内涵筛选分析，以评估这些基因对脂质谱的影响，结果显示LAPTM5对棕榈酸（PA）刺激后肝细胞脂质蓄积具有最强的抑制作用（图1 f）。为了研究LAPTM5和NASH之间的相关性，作者检测了非脂肪变性和NASH患者肝脏LAPTM5的表达水平，结果发现NASH患者肝脏中LAPTM5表达水平明显低于非脂肪变性患者，且与NASH的分级评分呈负相关（图1 g-i）。与正常饮食的ob/ob小鼠和野生型小鼠相比，进行高脂饮食、高胆固醇饮食或缺乏蛋氨酸和胆碱饮食的两种小鼠的肝脏中，LAPTM5表达均显著减少，这与人类患者观察到的结果一致（图1 j）。总之，LAPTM5表达水平与NASH呈负相关关系，提示LAPTM5能够延缓病情发展。

图1. LAPTM5在脂肪肝中表达下调，并与NASH进展相关

二 、NEDD4L通过催化其K48连接的泛素化介导LAPTM5的蛋白降解

作者进一步探讨了NASH中LAPTM5下调的机制。胞内蛋白的降解可以通过泛素—蛋白酶体系统或自噬途径，使用PA刺激肝细胞并以不同途径的抑制剂来干预，发现蛋白酶抑制剂MG132阻断了LAPTM5的降解，而溶酶体抑制剂Chlq未能起到作用（图2 a，b）。接着IP-质谱检测发现NEDD4L、NEDD4、WWP2和ITCH可能参与LAPTM5的降解（图2 c）。通过CO-IP和GST沉淀分析表明，LAPTM5与NEDD4L之间具有较强的相互作用，且NEDD4L过表达可促进LAPTM5降解（图2 d-g）。然后，作者研究了NEDD4L促进LAPTM5降解的机制。检测了LAPTM5的泛素化情况，结果显示NEDD4L通过K48连接使LAPTM5泛素化，并由E3连接酶促进其降解（图2 h-m）。此外，还发现NEDD4L的表达在NASH中显著上调，证明NEDD4L也受到NASH的调控。

图2. NEDD4L通过催化其K48连接的泛素化来介导LAPTM5的蛋白质降解。

三 、LAPTM5抑制肝细胞的脂质蓄积和炎症

为了研究LAPTM5对肝细胞脂质代谢和炎症的影响，作者从Laptm5-KO小鼠和Laptm5-Flox对照小鼠中分离出原代肝细胞，这些细胞在体内已感染了LAPTM5过表达腺病毒（图3 a）。尼罗红染色结果显示，与对照组相比，Laptm5-KO组小鼠中PAOA明显加剧了肝细胞的脂质蓄积，并伴有甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）的升高，而Laptm5过表达改善了这一现象（图3 b，c）。此外，qPCR和WB结果进一步证实了LAPTM5对脂质代谢和炎症的抑制作用（图3 d-g）。再根据RNA-seq数据进行层次聚类分析，清晰地将PAOA处理的样本分为两个亚组：Laptm5-Flox-PAOA和Laptm5-KO-PAOA（图3 h）。值得注意的是，Laptm5敲除促进与脂代谢和炎症相关的生物学过程（图3 i-k）。总之，这些体外数据表明LAPTM5可以拮抗代谢应激诱导的肝细胞脂质蓄积和炎症。

图3. Laptm5-KO可加重肝细胞内的脂质堆积和炎症

四 、肝细胞特异性缺失LAPTM5会加剧脂肪性肝炎

接着作者探讨了LAPTM5对脂肪性肝炎及其并发症的影响。作者构建了肝细胞特异性Laptm5敲除（Laptm5-HKO）小鼠（图4 a），并用正常饲料或高脂饲料（HFD）喂养24周。正常饮食的Laptm5-HKO小鼠和Laptm5-Flox小鼠在体重、肝脏重量和血脂方面没有差异；而HFD饮食组中，Laptm5-HKO小鼠的体重、肝脏重量、空腹血糖以及肝脏和血清中的TG/TC均高于对照组，且肝脏出现严重的脂肪堆积，与脂质摄取（CD36）和合成（FASN、SCD1、PPARG和Srebf1）相关的基因表达上调（图4 b-m）。此外，与对照组相比，Laptm5-HKO小鼠中丙氨酸转移酶（ALT）和天冬氨酸转移酶（AST）均显著升高，表明肝脏受到了严重的损伤。因此，LAPTM5的特异性缺失进一步加剧了NAFLD（非酒精性脂肪肝病）的发展。

图4. Laptm5-HKO 加剧了HFD诱导的肝脂肪变性

作者为了探讨LAPTM5在NASH小鼠模型中的作用，用高脂和高胆固醇（HFHC）饲料喂养Laptm5-HKO和Laptm5-Flox小鼠16周。8周后，Laptm5-HKO小鼠的肝脏重量和空腹血糖等脂代谢指标以及脂质蓄积增加，16周时会进一步恶化，并且炎症和肝纤维化也会随之加重，血清ALT和AST升高（图5 a-j）。作者发现，在NASH中肝脏LAPTM5缺失会促进脂代谢、炎症和纤维化的多种途径和基因上调（图5 k-n）。总而言之，LAPTM5缺乏加重了小鼠的NASH。

图5. Laptm5-HKO 加剧了HFHC诱导的NASH

五、肝脏特异性过表达LAPTM5可减轻HFHC诱导的NASH

为了证实肝脏LAPTM5在NASH发病机制中的作用，作者构建了肝细胞特异性过表达Laptm5转基因（Laptm5-HTG）小鼠模型（补充图7 a，b），以同窝小鼠（NTG）作为对照。在HFHC喂养16周后，与NTG小鼠相比，Laptm5-HTG小鼠的肝脏重量较小、HFHC诱导的高血糖和恶化的脂代谢得到缓解、肝脂肪变性更轻并减轻了NASH期间的炎症、纤维化和肝损伤（补充图7 c-p）。以上结果表明，LAPTM5可以预防脂肪性肝炎及其代谢相关的并发症。

补充图 7. 肝细胞特异性LAPTM5过表达减轻HFHC诱导的NASH

六 、LAPTM5通过促进CDC42的溶酶体降解来抑制MAPK信号通路的激活

为了研究LAPTM5抑制NASH的机制， 作者通过RNA测序和KEGG分析等实验结果发现，LAPTM5与MAPK信号通路相关，且呈负相关（图6 a-e）。接着发现LAPTM5与小GTP结合蛋白CDC42（细胞分裂周期蛋白42）相互作用（图6 f），CDC42过表达显著加重了脂质蓄积、炎症反应且促进了肝细胞中MAPK信号的激活。随后，CO-IP和GST测定证实了LAPTM5和CDC42之间存在相互作用，且LAPTM5过表达抑制了PA诱导下CDC42的表达，LAPTM5敲除则反之（图6 g-l）。此外，与非NASH患者相比，NASH患者肝组织中CDC42表达明显上调，进一步说明LAPTM5与CDC42呈负相关（图6 m）。通过MG132和Chlq处理LAPTM5过表达的肝细胞，发现溶酶体抑制剂Chlq可以消除LAPTM5对CDC42的抑制作用（图6 n，o）；并且在PA处理后，CDC42逐渐向溶酶体移动，最终与LAPTM5过表达细胞中的溶酶体共定位，结果表明LAPTM5促进了CDC42向溶酶体转运从而将其降解（图6 p）。

图6. LAPTM5通过促进CDC42的溶酶体降解来抑制MAPK信号通路的激活

七 、CDC42介导LAPTM5对肝细胞脂质蓄积和炎症的影响

接下来，作者验证了LAPTM5-CDC42轴是否存在于NASH中。作者发现，在LAPTM5过表达的肝细胞中过表达CDC42消除了LAPTM5对脂代谢应激的抑制、上调了MAPK信号通路（图7 a-d）。相反，敲除LAPTM5后再敲低CDC42，则抑制了肝细胞的脂质蓄积和炎症反应（图7 e-h）。这些结果表明，LAPTM5通过介导CDC42的降解来延缓NASH的发展。

图7. CDC42 介导了LAPTM5对肝细胞脂质沉积和炎症的影响

八 、腺病毒介导的肝脏LAPTM5过表达减轻了非酒精性脂肪肝炎

最后，作者探讨了靶向LAPTM5-CDC42轴对NASH的治疗效果。将过表达LAPTM5的腺病毒（Ad-LAPTM5）注射到已接受8周HFHC饮食的小鼠体内，再进行HFHC喂养4周，以Ad-GFP作为对照（图8 a）。结果发现，与Ad-GFP相比，LAPTM5过表达下调了小鼠肝脏中p-JNK1/2和CDC42的表达，空腹血糖、肝脏重量和肝脏重量与体重的比值也显著降低，改善了肝脏的脂质蓄积、炎症和肝损伤（图8 b-m）。以上结果表明，LAPTM5作为靶点在治疗NASH和代谢紊乱中具有良好的前景。

图8. 腺病毒介导的LAPTM5过表达减轻了非酒精性脂肪性肝炎

综上所述，LAPTM5可在代谢应激下被NEDD4L泛素化降解。LAPTM5过表达减轻了肝的脂肪性病变、炎症反应以及纤维化。从机制上看，LAPTM5可直接与CDC42结合，促进其进入溶酶体降解，以抑制p38/c-JNK通路的激活，从而发挥保护肝细胞的功能。因此，靶向肝细胞LAPTM5可成为治疗NASH的有效方案，值得进行进一步的临床研究。