自噬干货分享系列之经典自噬研究

自噬最早于1962年由Ashford 和 Porter两位学者提出，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象。
根据底物进入溶酶体途径的不同，可将自噬分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬（CMA）。由脂质膜结构包绕带降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物的过程称为大自噬，即我们通常所说经典自噬。小自噬也发生相同的包绕过程，但包绕底物的是自身发生内陷的溶酶体膜。CMA是指胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中并消化的过程，CMA在清除蛋白质是有选择性，底物为可溶的蛋白分子[1]。

图1. 大自噬、小自噬、CMA图解

细胞自噬参与调节细胞物质的合成、降解和重新利用之间的代谢平衡，对实现细胞代谢需要、更新某些细胞器并维持细胞内稳态有较重要的作用。由此可见，自噬处于一个稳定的水平对我们的生命健康十分重要，越来越多的研究表明自噬失调可能与肿瘤、感染、神经退行性变等疾病相关，因此对自噬的研究具有重要的应用价值[2]。那么，如何研究自噬与疾病之间的关联性，常用的研究思路是什么？需要用到哪些检测自噬的工具？接下来，将一一介绍，在文章最后会分享两个经典自噬的研究案例帮助小伙伴们理解。在之后的自噬干货分享系列中会针对如何研究其他自噬作详细介绍，感兴趣的同学们可以关注后续的干货分享哦。

1、自噬研究经典思路

一个清晰的研究思路是做研究的第一步，也是非常关键的一环，明确研究思路之后设计实验方案或是查找参考文献才能事半功倍，自噬研究的常用思路可参考下图。

图2. 自噬研究的思路

2、自噬研究常用工具

根据研究思路确定实验方案之后，自然是要选择合适的研究工具。目前，检测自噬水平的方法主要有三种：

（1）电镜观测自噬体的形成，该方法最为直接，但是仅能证明自噬的存在，难以反应自噬活性的强弱。

（2）通过Western Blot检测标志物，如LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。这种方法操作相对简单，可以做到半定量检测。

（3）检测自噬流，即在荧光显微镜下采用GFP-RFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。这种检测方法是使用GFP-RFP标记及追踪LC3，利用GFP（绿光）在酸性环境中淬灭的特性来观察自噬[3]，是目前自噬研究最常用的方法之一，其具体的作用原理可见图3。

图3 GFP-RFP-LC3作用原理图

汉恒生物作为国内首个研究自噬的公司，研发了多种自噬研究工具。mRFP-GFP-LC3是研究细胞自噬最常用的工具之一，在mRFP-GFP-LC3的基础上汉恒生物研发出了AAV-LC3工具，可实现在体自噬监测。后续还研发出了可定位细胞器的自噬研究工具，其原理是用细胞器-RFP（红光）和LC3-GFP（绿光）分别标记细胞器和自噬小体，实现两者的共定位，例如线粒体定位的RFP（mito-RFP）、高尔基体定位的RFP（Golgi-RFP）、溶酶体定位的RFP（Lyso-RFP）等，具体可见表1。关于如何根据研究需求选择并应用这些工具，将会在之后的干货分享中详细介绍，感兴趣的小伙伴可以留意一下哦。

表1 自噬研究工具

3、应用案例

2018年江苏大学张徐团队[4]通过体外培养从人外周血分离的中性粒细胞，来研究胃癌细胞来源的外泌体(GC-Ex)对中性粒细胞促肿瘤激活的影响。作者通过检测中性粒细胞中的LC3发现中性粒细胞在癌症进展中的促进作用与自噬激活有关，接着作者使用自噬抑制剂处理中性粒细胞，观察到中性粒细胞诱导的胃癌细胞迁移明显受到了抑制，表明中性粒细胞的自噬在胃癌进展中起关键作用。然后作者在自噬的不同阶段使抑制或激活自噬，通过检测LC3-II和ATG家族基因的表达水平，得出结论：GC-Ex通过HMGB1/TLR4相互作用激活NF-κB通路诱导中性粒细胞自噬，激最终促进胃癌细胞的增殖和迁移。这一研究结果为胃癌诊断、预后和治疗提供了新的思路。

图4 敲除HMGB1对中性粒细胞自噬的影响（检测LC3、p65、ATG7等标志物）

2022年，第四军医大学一个研究团队发现TRPC1可能通过介导心肌凋亡和自噬参与心功能障碍是内毒素血症（ETM）诱导的心功能障碍的发病机制，为进一步阐明TRPC1的作用机制，研究人员使用携带CMV-mRFP-GFP-LC3的腺相关病毒（AAV9）（汉恒提供）对实验小鼠进行心肌内注射以检测自噬通量。研究结果表明TRPC1可促进lps触发的细胞内Ca2+释放，介导小穴蛋白-1减少，进而激活calpain调节心肌凋亡和自噬，从而导致ETM诱导的小鼠心功能障碍[5]。

图5 小鼠心脏在攻毒前4周转染AAV9-mRFP-GFP-LC3荧光图像

至此，本期内容就结束了，主要介绍了自噬的概念，研究思路和工具并分享了两个关于大自噬的研究案例，大家是否对自噬有了一个大致的了解呢，下期我们将继续自噬干货分享之内质网自噬，我们下期见哦。

参考文献：

叶青,郑民华.自噬的分子机制与病理生理意义[J].国际病理科学与临床杂志,2007,(04):358-362

马泰,孙国平,李家斌.细胞自噬的研究方法[J].生物化学与生物物理进展,2012,39(03):204-209.

Noboru Mizushima,Leon O. Murphy. Autophagy Assays for Biological Discovery and Therapeutic Development[J]. Trends in Biochemical Sciences,2020.

Zhang Xu,Shi Hui,Yuan Xiao,Jiang Pengcheng,Qian Hui,Xu Wenrong. Tumor-derived exosomes induce N2 polarization of neutrophils to promote gastric cancer cell migration.[J]. Molecular cancer,2018,17(1).

Tian, Wen., Liu, Shao-Yuan., Zhang, Meng., Meng, Jing-Ru., Tang, Na.. TRPC1 contributes to endotoxemia-induced myocardial dysfunction via mediating myocardial apoptosis and autophagy. Pharmacological research, 2022.