慢病毒、腺病毒、腺相关病毒答疑专场

慢病毒

1.慢病毒能不能用于动物实验？效果怎么样？

不建议使用慢病毒。因为动物实验需要的病毒量大，且病毒的滴度要很高，这样才能达到最小体积注射足够病毒的目的。慢病毒滴度较低，一般达不到动物实验的要求。

2.慢病毒感染效率低怎么办？如何提高？

可以提高MOI值、加polybrene助转染试剂；如果细胞本身难以感染可是尝试使用腺病毒。

3.慢病毒载体插入多大外源基因，病毒滴度会明显下降？

载体容量在3kb左右，超过500+或1000+就会影响。

4.慢病毒敲低构建成细胞稳转株的话，需要多少病毒量？

需要做预实验，摸索最佳MOI. （可以去https://www.hanbio.net/download/ 下载慢病毒搜做手册，查看具体方法）

5.siRNA瞬转验证能稳定敲低的序列，可以直接用来包慢病毒吗？

可以。用于不同的细胞，感染效率不一样。

6.什么时候用到慢病毒构建载体？

当我们需要稳定表达的时候，如果需要构建稳转株，做一些体内实验，就可以用慢病毒；悬浮细胞，比如T细胞，用慢病毒感染效果会比较好。

7.慢病毒感染后细胞状态异常了，主要是什么原因？

一方面可以考虑一下病毒感染前的细胞状态，是否已经出现了下降；有些细胞本身就对外来的东西比较敏感，特别是病毒，如果是这种比较敏感的细胞的话，就不太适用慢病毒的感染；还可以调整MOI,实验前先对MOI进行摸索，如果MOI过高，一定会影响细胞的状态。

8.原代脂肪细胞用慢病毒筛选可以吗？

如果要做稳转株的话，就不太建议用原代细胞了，因为原代细胞传代效果不好；如果是为了筛选，把那些没有感染上的阴性筛走的话，可以用原代细胞。

9.慢病毒转染细胞构建稳转株，但是在传代十代以内或者冻存前后发现不再稳转表达，这个情况正常吗 可能存在什么问题呢 ?

正常情况下会出现下降，可以用抗性去筛选，绝大部分细胞没有转染成功的细胞被杀死了，但是不排除里面还有一些没有转染成功的的细胞存在里面，这些细胞有可能在后期传代的时候处于增值优势状态的，比如说这些细胞的比例增加，就检测到表达的倍数发生了变化。用慢病毒包装的目的序列，也是会存在一种丢失的风险，所以说筛完稳转株以后，我们不定时的去加抗生素压一压。

10.哪种情况需要用慢病毒包装后再转染？

要看细胞的转染效率，如果质粒转染效率很好就用质粒 ，如果要做很多基因的敲除，可以用慢病毒做Cas9稳转株，后续再转gRNA质粒就可以了。

11.为什么有的慢病毒包毒难呢？

一般跟目的基因有一点的关系，以及慢病毒的质粒的质量。

12.细胞转染实验，如何选择病毒包装？

工具病毒选择指南及常见问题答疑 (hanbio.net)

13.慢病毒感染需要注意哪些？

慢病毒感染 - 小红书 (xiaohongshu.com)

小小慢病毒感染-拿下拿下 - 小红书 (xiaohongshu.com)

14.慢病毒和腺病毒该如何选择？

慢病毒和腺病毒的区别 - 小红书 (xiaohongshu.com)

工具病毒选择指南及常见问题答疑 (hanbio.net)

慢病毒和腺病毒，该怎么选？

15.请问悬浮细胞可以用慢病毒感染吗？效率高吗？

可以，但是慢病毒感染的效率并不高，建议优先试用腺病毒进行感染，推荐使用汉恒生物悬浮细胞专用腺病毒悬浮细胞转染专用腺病毒 (hanbio.net)。

16.转染完成以后24小时培养基变黄了是什么原因呢，对慢病毒滴度有影响吗？

（是说在慢病毒包装的时候转染完质粒24小时培养基变黄了是吗？）这时候要确认一下293t细胞的状态是不是本身就不太好，在脱板的时候是不是密度过高，确定培养基是否被污染。

17.请问慢病毒转染后细胞很绿但是长不起来？

细胞很绿的话就要考虑一下是不是MOI值太高了，导致慢病毒对细胞的毒性比较大，从而影响细胞的状态

腺病毒

1. 腺病毒的两种包装系统怎么选择？

这两种包装系统主要是根据实验室的需求。推荐观看该干货内容腺病毒 - 小红书 (xiaohongshu.com)。

2. 滴度怎么测？

空斑法。就是将最终纯化出来的腺病毒稀释成不同浓度去感染293A细胞，然后去计算空斑的平均数，再跟进平均的空斑数和稀释的倍数去带入公式计算就可以了，操作就是跟空斑法的实验是一样的。详情可见《病毒包装实验秘籍》。

3.腺病毒感染的空斑和细胞聚集怎么区分？

可以先继续培养几天，看一下疑似的区域有没有发生扩散，如果是持续的发生扩散的话，一般可以认为是病毒的空斑，如果聚集的区域一直保持不变的话，那可能就是细胞聚集。

腺相关病毒

1．腺相关病毒载体是不是只要能转入到细胞就能整合到宿主细胞基因组中？

腺相关病毒不能整合到宿主细胞中。慢病毒才能整合。

2.AAV注射方式，尾静脉注射和局部原位注射怎么选？

看需要感染的部位。如果靶向性较好，选尾静脉注射；如果靶向性更强且需要在局部表现，选局部原位注射。

3:腺相关病毒和慢病毒感染宿主细胞，哪个整合效率高，哪种病毒感染获得的克隆表现更稳定？

腺相关病毒并不是一个整合到宿主基因组为主的病毒，因为他没有带逆转录系统，慢病毒才带有逆转录系统，腺相关病毒只有一小部分可能会整合上去，他主要的维持方式是以一种环装的伴随体形式（单体或双倍体或四倍体），并不是完全的整合倒了宿主的基因组上。

4.aav是无法直接对细胞水平感染的是吗？

可以感染。但是不建议用AAV感染细胞，因为细胞实验腺相关病毒的MOI值一般建议在104以上，用量非常大，并且腺相关病毒买的血清型不一定针对这个细胞效果好，就是用量大，效果还不一定好。

5.AAV的纯化方式是什么？

纯化柱纯化。

6.腺相关病毒，可以持续3-6个月，那干预的时候，只用注射一次吗？

稳妥起见，建议2个月补打一次。

7.肺部最好用AAV几型？

AAV5型或AAV6型。

8.观察动物活体成像，AAV选择带荧光蛋白基因好还是荧光素酶基因好？

一般来讲荧光素酶基因会更好。