胰腺组织干货篇-AAV胰腺组织特异性表达调控

前两期中，为大家介绍了视网膜和肌肉组织的靶向调控策略，本期我们为大家带来AAV在胰腺组织研究中的靶向策略。

胰腺是一个兼具内、外分泌功能的腺体，它的生理作用和病理变化与生命息息相关。胰腺实质由外分泌部和内分泌部两部分组成。外分泌部的腺泡细胞分泌胰液，含有多种消化酶，经各级导管排入十二指肠，在食物消化中起重要作用。内分泌部是散在于外分泌部之间的细胞团，被称为胰岛，多种细胞分泌不同激素，如β细胞分泌胰岛素，α细胞分泌胰高血糖素，δ细胞分泌生长抑素，这些激素进入血液或淋巴，参与生理调节。

胰腺的体内基因递送，特别强调基因转移到特定细胞来研究和剖析关键基因在胰腺疾病发展过程的生理病理作用。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）作为基因递送的重要载体之一，具有高安全性和物种兼容性。针对不同组织和不同细胞选择合适的血清型、特异性启动子和注射方式可以有效提高外源基因的组织特异性表达效率，接下来，和小恒一起学习AAV在胰腺疾病研究中的靶向递送策略。

一、血清型的选择

重组AAV通过改变包装质粒中的cap基因来改变血清型，使其具有不同的组织趋向性或易感细胞类型。已有的研究表明AAV6、AAV8、AAV9、AAV-Pan对胰腺具有较好的感染能力，其中AAV8型运用最为广泛，而aav6对胰腺导管等具有较好的感染效率[2]。

Jimenez V等通过导管注射将不同血清型AAV注射至胰腺，并在一个月后取样进行免疫荧光检测，腺泡细胞在测试的所有血清型和剂量下有效且广泛转导（图1-a），导管细胞可被AAV6有效感染（图1-b），而AAV8、AAV9胰腺整体感染效率更佳[1]。而另一项研究中，Quirin KA等人使用scAAV进行导管逆行注射感染胰腺，如图2所示，AAV6更好地感染腺泡细胞（图2-C），导管（图2-D）和胰岛（图2-E）[2]。

图1 不同血清型的AAV-CAG-GFP通过导管注射对胰脏腺泡细胞进行感染

图2 不同血清型的scAAV-EF1a-eGFP通过导管注射对胰腺进行感染

二、组织（细胞）特异性启动子

胰腺中细胞构成复杂，不同启动子的应用可以帮助研究者实现目的基因在不同细胞中的表达选择性。在研究中可以选择广谱性启动子CMV，也可以针对不同细胞选择相应的特异性启动子以获得最佳表达效果，如对于导管细胞可选择sox9启动子，对于胰腺β细胞可选择Insulin2（Ins2）启动子，在胰岛α细胞中可选择GCG作为特异性启动子，在转基因小鼠中也常应用Pdx1启动子在胰腺中实现基因特异性表达。

1.胰岛β细胞启动子-pxd1

Pdx1是在发育中的胰腺最早表达的基因之一，该基因随着个体发育在β细胞中逐渐高表达，在腺泡和其他内分泌细胞中的水平较低。该启动子常见于靶向胰腺的转基因小鼠，通过利用源自Pdx1启动子上游调控区域的不同增强子片段，已经衍生出具有胰腺特异性且靶向性更高的其他Cre基因鼠品系[3]。如图3所示，Kang R等人将Pdx1-Cre小鼠与带有floxed HMGB1小鼠杂交后产生纯合胰腺细胞HMGB1敲除小鼠，通过基因分型分析证实了小鼠基因型以及胰腺细胞中HMGB1基因的表达[4]。

图3 使用Pdx1启动子在胰腺组织中特异性敲除HKGB1

2.胰岛β细胞启动子-Ins2

Insulin基因编码胰岛素，其在啮齿类中具有两个拷贝，分别为Ins1和Ins2，目前认为Ins1来自于Ins2的部分反转录，但两者带有相同的调节区，Ins2和Ins1启动子都被广泛应用在基因工具鼠和AAV的组织特异性基因表达中，大鼠Ins2启动子又被称为RIP。在《NR3C1/Glucocorticoid receptor activation promotes pancreatic β-cell autophagy overload in response to glucolipotoxicity》中，Wu T等研究者构建了由Ins2启动子特异性启动目的基因转录的AAV8载体，并通过腹腔注射递送至胰岛，目的基因表现出有效的胰岛β细胞特异性表达[5]。

图4 AAV-Ins2-Nr3c1特异性感染胰腺β细胞

3.胰岛α细胞启动子-GCG

GCG基因编码一种可被切割成四个不同的成熟肽前蛋白，其中一种成熟体为胰高血糖素，其由胰岛α细胞分泌，能够抑制胰岛素的分泌并促进肝糖原的分解，从而升高血糖。在使用导管注射将带有GCG启动子的AAV8转导至胰腺10天后，超过96%的胰高血糖素阳性α细胞具有GFP的表达[6]。

图5 AAV8-GCG-Pdx1-MafA-GFP感染胰岛α细胞

表一所列为汉恒生物提供的用于胰腺特异性表达调控的启动子，并有试用装可供试用，欢迎咨询。

表一 汉恒生物胰脏特异性启动子

三、注射方式

常见的胰腺给药方式包括系统性注射和胰腺导管内注射，系统性注射如静脉注射、腹腔注射侵入性小、操作简便，但胰腺转导效率较低，小鼠注射剂量一般在10^11 vg以上；导管注射具有一定操作门槛，但在感染效率上较全身给药更高[2]。

图6 AAV经胆总管经胆囊管逆行导管内输注

表2 导管注射参考剂量[7]

相信大家对胰腺领域的AAV应用有了一个初步了解，除本文用到的胰腺组织特异性启动子AAV病毒外，汉恒生物还研发了靶向神经、肌肉、肾脏、肝脏、视网膜等组织器官的AAV特异性启动子和特异性血清型，欢迎各位老师同学咨询。使用合适的血清型和特异性启动子，可对不同组织器官进行靶向高效感染，在下期的内容中我们将会分享肝脏相关的AAV特异性基因调控策略，敬请关注。

四、参考文献

[1] Jimenez V, Ayuso E, Mallol C, Agudo J, Casellas A, Obach M, Muñoz S, Salavert A, Bosch F. In vivo genetic engineering of murine pancreatic beta cells mediated by single-stranded adeno-associated viral vectors of serotypes 6, 8 and 9. Diabetologia. 2011 May;54(5):1075-86. doi: 10.1007/s00125-011-2070-3. Epub 2011 Feb 11. PMID: 21311856.

[2] Quirin KA, Kwon JJ, Alioufi A, Factora T, Temm CJ, Jacobsen M, Sandusky GE, Shontz K, Chicoine LG, Clark KR, Mendell JT, Korc M, Kota J. Safety and Efficacy of AAV Retrograde Pancreatic Ductal Gene Delivery in Normal and Pancreatic Cancer Mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Sep 30;8:8-20. doi: 10.1016/j.omtm.2017.09.006. PMID: 29349096; PMCID: PMC5675991.

[3] Magnuson MA, Osipovich AB. Pancreas-specific Cre driver lines and considerations for their prudent use. Cell Metab. 2013 Jul 2;18(1):9-20. doi: 10.1016/j.cmet.2013.06.011. PMID: 23823474; PMCID: PMC3732107.

[4] Kang R, Zhang Q, Hou W, Yan Z, Chen R, Bonaroti J, Bansal P, Billiar TR, Tsung A, Wang Q, Bartlett DL, Whitcomb DC, Chang EB, Zhu X, Wang H, Lu B, Tracey KJ, Cao L, Fan XG, Lotze MT, Zeh HJ 3rd, Tang D. Intracellular Hmgb1 inhibits inflammatory nucleosome release and limits acute pancreatitis in mice. Gastroenterology. 2014 Apr;146(4):1097-107. doi: 10.1053/j.gastro.2013.12.015. Epub 2013 Dec 17. PMID: 24361123; PMCID: PMC3965592.

[5] Wu T, Shao Y, Li X, Wu T, Yu L, Liang J, Zhang Y, Wang J, Sun T, Zhu Y, Chang X, Wang S, Chen F, Han X. NR3C1/Glucocorticoid receptor activation promotes pancreatic β-cell autophagy overload in response to glucolipotoxicity. Autophagy. 2023 Sep;19(9):2538-2557. doi: 10.1080/15548627.2023.2200625. Epub 2023 Apr 20. PMID: 37039556; PMCID: PMC10392762.

[6] Guo P, Zhang T, Lu A, Shiota C, Huard M, Whitney KE, Huard J. Specific reprogramming of alpha cells to insulin-producing cells by short glucagon promoter-driven Pdx1 and MafA. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023 Feb 11;28:355-365. doi: 10.1016/j.omtm.2023.02.003. PMID: 36879848; PMCID: PMC9984919.

[7] Xiao X, Guo P, Prasadan K, Shiota C, Peirish L, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Wiersch J, El-Gohary Y, Husain SZ, Gittes GK. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 2014 Dec;9(12):2719-24. doi: 10.1038/nprot.2014.183. Epub 2014 Oct 30. PMID: 25356582; PMCID: PMC4734891.