实现组织特异性干扰的辅助工具—miR30结构

RNA干扰（RNAi）是一种进化上保守的转录后基因调控机制，它是由双链RNA（dsRNA）诱发同源mRNA高效特异性降解从而抑制基因表达的现象，是研究基因功能常用的手段之一。用于诱导持续的RNAi的手段，是用pol III型启动子表达shRNA，常用的pol III型启动子有U6和H1，由于构建序列较短，shRNA能够轻易地插入病毒载体，但是要想实现特定组织中的基因沉默，几乎少不了组织特异性启动子的助力，然而U6和H1并不具有组织特异性，显然无法达到实验目的，有什么方法可以解决这个问题呢？答案就是利用miR30结构。本期小编将从基于miR30的shRNA、miR30结构的优势、案例分析三个方面为大家介绍用于组织特异性干扰的有力辅助工具—miR30结构。

一、基于miR30结构的shRNA介绍

首先，我们先简单了解下miRNA的成熟过程：

①初级miRNA（pri-miRNA）在核内被Drosha/ DGCR8复合物识别并加工成前体miRNA（pre-miRNA）

②pre-miRNA通过Exprotin-5复合物转运到细胞质中被Dicer酶剪切，最终形成成熟的双链miRNA

miRNA和shRNA的成熟依赖于非常相似的细胞机制，只是miRNA多了一步核内的加工过程（见图1），这一发现打开了使用前体miRNA二级结构作为生产siRNA骨架的大门，这种方法可以使shRNA以更自然的方式进行加工剪切（见图2），最大限度地减少不必要的副作用，而且插入miRNA骨架的shRNA序列更长，因此可由pol II型启动子（包括多种组织特异性启动子）驱动，从而实现特定组织中的基因沉默。目前用于干扰作用的miRNA骨架（如miR30、miR155、miR17-92等）中，最常用的就是miR30结构。

图1. shRNA和miRNA成熟和作用机制[1]

图2. 基于miR30结构的shRNA加工途径[2]

在已知miRNA和shRNA作用原理的情况下，研究者们将天然miR30A的主要的部件替换，形成了人工合成的miR30结构。那么和天然的miR30A相比，改造的miR30主要有哪些不同呢？

图3. 天然miR30A与工具miR30结构的区别[3]

如上图3所示，和天然miR30A相比，工具miR30结构的特点为：

1.Guide部分在反向链上，且茎环没有凸起

2.为设计shRNA 3’端的垂悬碱基，Loop部分的两个保守碱基对由CU/GG变为UA/UA

3.两侧引入了XhoI/EcoRI酶切位点，以便克隆

经过不断的优化和测试，形成了如今使用较为成熟的工具miR30结构。相信看到这里的小伙伴们对miR30结构有了更深入的了解，那么shRNA具体怎么构建到miR30骨架中的呢？

具体构建方案为：将miR30的5'flanking region和3'flanking region以及loop序列保留，然后将其成熟区域的序列替换成靶点序列，示意图如下：

图4. 基于miR30结构的shRNA载体

二、Mir30干扰结构的优势分析

（1）启动子选择性多：基于miR30的shRNA可以通过多种pol II启动子转录，包括CMV、CAG、诱导型启动子和组织特异性启动子等，尤其是组织特异性启动子，在这类启动子的作用下，利用miR30结构实现的基因敲低往往只限于某些特定的组织或器官，同时表现出发育调节等特性。汉恒生物为科研工作者提供近50种特异性启动子，能够实现不同组织/细胞的特异性表达，以下是汉恒生物的特异性启动子现货库列表：

表1. 汉恒生物组织/细胞特异性启动子现货库列表

（2）实现多个shRNA共表达：由于pol II型启动子可以启动较大的基因转录，因此多个shRNA可由单个pol II型启动子驱动表达；

（3）基于miR30结构的shRNA不太容易通过干扰内源性miRNA途径引起细胞毒性[3]；

（4）miR30的天然环状结构能确保精确的Dicer切割并减少脱靶效应[3]。

三、汉恒客户Mir30干扰经典案例分享

案例1-肝脏特异性敲低

文章标题：G protein-coupled receptor 35 attenuates nonalcoholic steatohepatitis by reprogramming cholesterol homeostasis in hepatocytes

杂志：《Acta Pharmaceutica Sinica B》（IF=14.5）

合作客户：安徽医科大学 王华教授和王学富副教授团队

使用病毒：AAV8-TBG-miR30-shRNA(Stard4)-mcherry

使用方法：尾静脉注射，1 × 1011 vg/mouse 。

图5. AAV特异性敲低肝脏中的Stard4[4]

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36970193/

案例2-神经元特异性敲低

文章标题：Hyperactive neuronal autophagy depletes BDNF and  impairs adult hippocampal neurogenesis in a corticosterone-induced mouse model of depression

杂志：《Theranostics》（IF=12.4）

合作客户：沈阳药科大学 吴春福教授团队

使用病毒：AAV-hSyn-miR30-shRNA(Atg5)

使用方法：脑立体定位注射，以0.2μL/min的速率分别注射到DG的两侧（1μL/侧）。

图6. AAV特异性敲低神经元中的Atg5[5]

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36793868/

案例3-肺巨噬细胞特异性敲低

文章标题：NLRC3 Expression in Macrophage Impairs Glycolysis and Host Immune Defence by Modulating the NF-ĸB-NFAT5 Complex During Sepsis-induced Immunosuppression

杂志：《Molecular Therapy》（IF=12.9）

合作客户：华中科技大学同济医学院附属协和医院 尚游教授团队

使用病毒：AAV-SP146-miR30-shNLRC3-eGFP

使用方法：气管内注射，1 × 1011 vg/mouse。

图7. 使用AAV特异性敲低肺巨噬细胞的NLRC3[6]

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.08.023

由此可见，miR30结构结合组织特异性启动子能够有效实现特定组织/细胞的基因沉默！现已广泛应用于神经、心脏、内皮、肝脏等多个研究领域。

参考文献：

[1] Luke S Lambeth., Craig A Smith. Short hairpin RNA-mediated gene silencing. Methods Mol Biol. 2013; 942:205-32.

[2] Xavier Bofill-De Ros1 and Shuo Gu. Guidelines for the optimal design of miRNA-based shRNAs. Methods. 2016 July 1; 103: 157-166.

[3] Fellmann C., Hoffmann T., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 2013 Dec 26; 5(6):1704-13.

[4] Wei X., Fan Y., et al. G protein-coupled receptor 35 attenuates nonalcoholic steatohepatitis by reprogramming cholesterol homeostasis in hepatocytes.Acta Pharm Sin B. 2023 Mar; 13(3):1128-1144.

[5] Zhang K.,Wang F., et al. Hyperactive neuronal autophagy depletes BDNF and  impairs adult hippocampal neurogenesis in a corticosterone-induced mouse model of depression. Theranostics.

2023 Jan 22; 13(3):1059-1075.

[6] Xu J., Gao C., et al. NLRC3 Expression in Macrophage Impairs Glycolysis and Host Immune Defence by Modulating the NF-ĸB-NFAT5 Complex During Sepsis-induced Immunosuppression. Mol Ther. 2023 Jan 4; 31(1):154-173.