干货篇-神经胶质细胞特异性基因调控策略

神经组织的细胞类型大体分为两类：神经元细胞和神经胶质细胞；神经元细胞是构成神经系统结构和功能的基本单位，神经胶质细胞包括分布在中枢神经系统中的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞，以及分布在周围神经系统中的施万细胞和位于脊神经节内的卫星细胞等。

表1 神经胶质细胞的主要分类及形态和功能

由于神经性疾病临床症状复杂，病因难以判断，神经细胞损伤后难以再生以及血脑屏障对药物输送的限制，采用药物和机械性手术治疗不仅难度高，且治疗效果有限，无法根治。因此，研究人员着眼于内源性途径寻找治疗方法，通过研究发病机制，确认关键基因靶点，采用基因治疗法从根本上治疗疾病，恢复患者的神经功能。腺相关病毒（AAV）因其独有的特点，是目前基因治疗的重要载体之一。那么如何用AAV去靶向神经胶质细胞呢？本文将详细介绍针对不同种类的胶质细胞，从血清型和特异性启动子两个方面详细介绍利用AAV载体实现神经胶质细胞特异性基因调控的策略，并结合相关案例进行注射方式的介绍，希望能够为做相关研究的老师提供帮助。

一、血清型选择

AAV有多种血清型，目前已发现有至少12种野生血清型以及100多种变体，其区别主要在于Cap基因（编码衣壳蛋白）的不同。不同的血清型对不同的组织或器官亲和性不同，从而导致对不同的组织和细胞感染效率不同，这对研究不同的疾病提供了方便性和可选性。可以通过对编码cap基因的 RC质粒进行改造，获得不同血清型的RC质粒。在包装病毒时，将RC质粒、helper质粒以及含有目的基因的AAV表达质粒一起转染293细胞，获得不同血清型的重组AAV病毒颗粒（rAAV）。

Cearley和Wolfe两位学者研究发现AAV9可将载体基因组运输到远端神经元细胞。Foust等研究发现在小鼠中静脉注射AAV9，可以有效地靶向小鼠的大脑和脊髓。之后越来越多的研究表明AAV9是在中枢神经系统中实现基因稳定表达最合适的血清型。汉恒生物的实验室对AAV9进行了转导测试，效果见图1。

图1 脑区基因转导(图片来源于汉恒生物）

神经性疾病研究的难点之一是血脑屏障（Blood–Brain Barrier，BBB）的存在，BBB是一种大脑血管、细胞以及其它组成大脑组织之间的保护性屏障，能为大脑提供一种防御机制来抵御血液中的外来病原体和毒素等。汉恒生物研发出了可穿过血脑屏障的AAV-BBB，尾静脉注射小鼠即可达到感染全脑的效果，详见图2。

图2 汉恒AAV/BBB病毒注射小鼠尾静脉可突破血脑屏障感染脑组织（图片来源于汉恒生物）

除此之外，汉恒生物也有AAV-cap-B10，可以更高效的穿越血脑屏障。如图3所示，发表在《Nat Neurosci》杂志上题为 “AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset”的文章，AAV-cap-B10病毒通过尾静脉注射可以高效的感染神经细胞而在同时对肝脏组织没有感染效果。

图3 在狨猴中，AAV-cap-B10特异性靶向神经细胞而非肝脏细胞

不仅如此，汉恒生物还有专注于神经小胶质细胞的血清型AAV-MG及其增强型AAV-MG1.2。如图4所示，发表在《Nat Methods》杂志上题为 “Directed evolution of adeno-associated virus for efficient gene delivery to microglia”的文章，AAV-MG1.2病毒通过尾静脉注射可以高效的感染小胶质细胞。

图4 AAV-MG1.2特异性靶向小胶质细胞

表2 神经组织特异性血清型

上表所列是汉恒生物提供的用于神经系统调控的特异性血清型，并有试用装可供试用，欢迎咨询试用。

二、特异性启动子

特异性血清型AAV可以靶向不同组织实现组织特异性感染，然而利用特异性血清型靶向的范围仍然较宽，且特异性血清型种类较少，如果想要在某种特定细胞上实现基因表达调控，仅使用不同的特异性血清型是难以实现的，而不同组织特异性启动子就比较丰富，汉恒生物针对各种神经胶质细胞类型推出了多种特异性启动子，可构建高效、特异性靶向不同细胞类型的rAAV载体。

表3 神经胶质细胞特异性启动子

上表所列是汉恒生物提供的用于神经胶质特异性表达调控的启动子，并有试用装可供试用，欢迎咨询试用。

1.星形胶质细胞特异性启动子

作为星形胶质细胞内的主要骨架蛋白，GFAP在细胞核和细胞膜之间形成连接，参与细胞内细胞骨架重组、细胞黏附、维持脑内髓鞘形成和神经元的结构以及作为细胞信号参与转导通路等，具有维护星形胶质细胞形态稳定、参与血脑屏障形成、调节突触等功能，因此GFAP可以作为星形胶质细胞特异性标志物。

如图5-6所示，是汉恒生物客户发表在《PAIN》杂志上题为“Astrocytic phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 regulates neuropathic pain by facilitating 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase–dependent cholesterol biosynthesis”的文章，通过鞘内注射AAV2/9-GFAP-r-PTEN-3Flag 和AAV2/9-GFAP-r-HMGCR-3Flag的AAV病毒，实现基因在星型胶质细胞特异性表达PTEN和HMGCR。

图5 GFAP特异性启动PTEN 基因在星型胶质细胞表达

图6 GFAP特异性启动HMGCR基因 在星型胶质细胞表达

2.小胶质细胞特异性启动子

小胶质细胞（microglia）是存在于大脑和脊髓中的巨噬细胞，在神经系统中，小胶质细胞不断清除斑块、受损的神经元和传染性物质，是主动免疫防御的主要形式。现在一般采用CD68、F4/80、iba1、TMEM119启动子作为小胶质细胞特异性启动子。

如图7所示，发表在《Molecular Therapy — Methods & Clinical Development》杂志上题为“Microglia-specific targeting by novel capsid-modified AAV6 vectors”的文章，通过脑室注射AAV- CD68-GFP和AAV- F4/80-GFP病毒，可以特异性的感染小胶质细，但同时对神经元和星型胶质细胞没有感染效果。

图7 CD68和F4/80启动子在小胶质细胞中特异性表达

如图8所示，发表在《COMMUNICATIONS BIOLOGY》杂志上题为 “Development of microglia-targeting adenoassociated viral vectors as tools to study microglial behavior in vivo”的文章，AAV/9 –iba1-GFP病毒可以特异性的感染小鼠大脑皮层小胶质细胞。

图8 iba1启动子在小胶质细胞中特异性表达

如图9所示，发表在《Annals of Translational Medicine》杂志上题为“Role of spindle pole body component 25 in neurodegeneration”的文章，AAV/ PHP.B -pTMEM-shSPC25病毒可以特异性的感染小鼠小胶质细胞HMC3，但同时对小鼠神经元细胞HCN-2，小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠成纤维细胞3T3没有感染效果。

图9 TMEM119启动子在小胶质细胞HMC3中特异性干扰spc25表达

3.少突胶质细胞特异性启动子

CNP特异性启动子是2',3'-cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase（2'，3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶）基因的启动子，可以作为少突胶质细胞或施万细胞特异性启动子。如图10所示，发表在《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》杂志上题为“Gene delivery targeted to oligodendrocytes using a lentiviral vector”的文章，因为CNP特异性启动子比较长达到2KB，以及AAV包装容量的有限性，文章选择使用慢病毒作为基因递送的载体。新生鼠大脑注射LV-CNP-GFP，发现CNP启动子可以特异性的在少突胶质细胞（CC1和Olig2）表达，但同时对神经元（NeuN），神经胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（CD11b）没有感染效果。

图10 CNP启动子在少突胶质细胞中特异性表达

MBP特异性启动子是myelin basic protein（髓鞘基质蛋白）基因的启动子，经典MBP基因编码的蛋白是神经系统少突胶质细胞的主要成分，因此MBP启动子可以作为少突胶质细胞特异性启动子。如图11所示，发表在《BRAIN》杂志上题为“Gene therapy targeting oligodendrocytes provides therapeutic benefit in a leukodystrophy model”的文章，使用AAV.MBP.Cx47myc及其对照病毒AAV.MBP.EGFP作为基因递送的载体。脑立体定位注射病毒至出生10天的小鼠脑内囊区，发现MBP启动子可以特异性的在少突胶质细胞（CC1）表达，但同时对神经元（NeuN），神经胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（iba1）没有感染效果。

图11 MBP启动子在少突胶质细胞中特异性表达

三、AAV注射方式

在神经研究中，我们常常采用脑立体定位注射、侧脑室注射、尾静脉注射等不同的注射方式。脑立体定位注射可根据不同的坐标感染特定的脑区，尾静脉注射感染范围较广，可结合汉恒生物跨血脑屏障血清型（AAV/BBB）感染全脑。

脑立体定位注射是神经研究中最常用的一种注射方式，如图12所示，是汉恒生物客户发表在《Advanced Science》杂志上题为“Genetic and Pharmacological Inhibition of Astrocytic Mysm1 Alleviates Depressive-Like Disorders by Promoting ATP Production”的文章，使用三种启动子启动的cre病毒AAV-CMV-Cre, AAV-GFAP-Cre, AAV-hSynCre，脑立体定位注射至小鼠MHb和HIP和IC脑区，以实现特异性的基因敲除。

图12 脑立体定位注射cre病毒

此外，还可以通过尾静脉注射可以穿透血脑屏障的AAV来达到感染全脑的目的。https://www.hanbio.net/academic/尾静脉注射视频资料，可以下载学习观看。

至此，本期内容就结束了，主要从AAV的血清型、启动子及注射方式三个方面介绍了特异性调控神经胶质细胞的策略，相信大家对AAV在神经胶质细胞领域的应用有了一个初步的了解，在下期的内容中我们将会继续分享在肾脏疾病方面的特异性基因调控策略。最后，欢迎大家关注汉恒生物公众号获取更多动物注射视频资料。

参考文献：

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