腺病毒怎么纯化，何时需要用纯化腺病毒

腺病毒既可以用于体内实验，也可以用于体外实验。如果是用于体外实验，可以选择非纯化的病毒；当用于体内实验时，则需要进行病毒纯化。因为未纯化的病毒载体中含有细胞碎片、培养基等杂质，这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主的免疫反应，所以在制备腺病毒载体时候非常关键的一步就是对其进行纯化。另外，纯化浓缩后的病毒滴度更高，更适合体内注射。

分离纯化各种病毒的最常用方法是密度梯度离心法，常用的介质有两种：CsCl和碘克沙醇。

下面分别介绍两种纯化方法：

汉恒生物采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法进行纯化

①PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。7000×g 4℃离心上述混合物 20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml密度为1.10 g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，PH8.0），病毒液应呈粉红色。

②CsCl梯度离心：加入2 ml密度为1.40 g/ml的CsCl溶液，然后再缓慢加入3 ml密度为1.30 g/ml的CsCl溶液，再加入5 ml的病毒悬浮液。使用Beckman SW28转子，26,000 rpm，4℃离心2小时。

表1、三种不同密度CsCl溶液的配制

图1 CsCl梯度离心示意图

③收集病毒：用注射器收集密度在1.30 g/ml和1.40 g/ml之间的病毒条带至透析袋中。（注：透析袋使用前用10 mM EDTA-Na2煮沸10 min，降至室温使用。）

④透析：在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl2，定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。

⑤重悬：500 μl PBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。

碘克沙醇密度梯度离心纯化法：

1. 准备不同浓度的碘克沙醇溶液:

在1 M NaCl的PBS-MK 配置15% (w/v) 碘克沙醇：1.5体积的溶液E + 2.7体积的溶液D +1.2体积的溶液C

在PBS-MK溶液中配置25% (w/v) 碘克沙醇：2.5体积的溶液E + 2.9体积的溶液C

在PBS-MK 溶液中配置40% (w/v) 碘克沙醇：4.0体积的溶液E + 1.4体积的溶液C

2、通过4次冻融来破坏含有病毒的细胞:在液态氮或干冰-甲醇中速冻细胞并在室温下解冻，然后涡旋重悬两次，每次30秒，每次涡旋后在冰上停留15s。

3、2000 g离心10分钟，获得澄清的细胞裂解液。

4、分别加入不同密度的分离液从下到上依次是：1ml 54%碘克沙醇工作液，3毫升40%碘克沙醇，3毫升25%碘克沙醇，1 ml 15%碘克沙醇，最上面加入4 ml澄清的裂解液（见图2）。

图2

5、在液体的最上层加入少量低密度矿物油，4℃，10万g离心 6-16小时。

6、收集腺病毒 （腺病毒带在40%碘沙醇层的顶部）。

纯化后的腺病毒自身诱导的免疫系统的激活产生的免疫细胞数量大幅减少，进而被清除的病毒颗粒减少，最终进入靶器官或组织的病毒量增加，拥有较高的基因表达效率，相比非纯化的腺病毒更加安全有效。但有研究表明腺病毒在体内维持时间较短且在同一宿主体内第二次使用腺病毒时基因表达效率降低，所以一般用于实验周期较短的动物实验，若实验周期较长，更推荐使用腺相关病毒（AAV）。