慢病毒构建稳定细胞株药物筛选细节盘点

稳转建系，是很多基因功能研究绕不过的实验。之前为大家介绍了构建稳定细胞株的方法与流程，今天再来详细盘点一下慢病毒构建稳定细胞株药物筛选细节。常见稳转株的两种筛选方式：流式分选和抗性药物筛选。流式分选依赖流式细胞仪，所以药筛是不少实验萌新的首要选择。然而，在勤勤恳恳选好转染工具，好不容易得到较好转染效率的阳性细胞后，因为后面的药筛细节不到位，导致结果差强人意的不在少数。到底是哪里出了问题呢？汉恒为大家整理了一篇详细的药筛Protocal，供大家参考。

1、常用的药筛抗生素种类及溶解保存:

嘌呤霉素(Puromycin)；新霉素/G418(Neomycin)；杀稻瘟菌素（Blasticidin）；潮霉素B(HygromycinB)；博来霉素(Zeocin/bleomycin)。

①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用0.22um滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；③所有抗生素贮液都应避光保存；④抗生素配置完成后，都需要分装成小份，方便取用，避免反复冻融。

2、杀死曲线（kill curve）建立

抗生素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处周期等有关，确定抗生素杀死未转染细胞的最低工作浓度至关重要。下面以嘌呤霉素为例：

Day1：准备24孔板，铺板目的细胞，第二天细胞汇合度应在50%～60%；

Day2：加入不同浓度梯度的嘌呤霉素，同时设置不加嘌呤霉素的对照组细胞，分别设置3个平行，排除其余干扰因素。具体梯度设置可以参考相关文献，或直接设置几个梯度，如：0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL；

Day3-4：每隔一天更换含嘌呤霉素的培养基，嘌呤霉素的筛选至少需要48 h（一般能杀死90%以上的细胞），有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2～10天。/p>

制作杀死曲线，选取48h内可杀死90%细胞的最低浓度作为后续稳转株筛选工作浓度。

3、稳转株筛选

Day1：细胞转染携带抗性基因的质粒/病毒48-72h后，在细胞汇合度在60%～70%时（细胞太密可先行传代，等待细胞贴壁再继续后面的筛选），在培养基中加入上述确定的工作浓度抗生素，同时设置空白细胞对照组（未转染质粒或病毒等）；

Day2-3：筛选至少48h，当空细胞加抗生素组死亡率＞90%，将含药筛抗生素培养基撤换为新鲜完全培养基，此时实验组剩下的基本可以认为是阳性细胞；

Day4～：对筛选的阳性细胞进行继续筛选和扩增（隔代加药维持阳性细胞率，维持浓度为工作浓度的一半，或根据空白细胞生长速度及细胞状态调整），进行细胞保种与复检。

至此即得到了混合克隆稳转株。

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