慢病毒使用答疑

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，能够将靶基因导入细胞，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，适用于几乎所以细胞系，能够在细胞系中稳定表达，还可以进行稳转细胞株的筛选。

慢病毒虽好，但是对于新手小白来说，仍有很多需要注意的问题，为了解答大家的疑惑，小恒整理了一些慢病毒感染细胞时的常见问题，希望能够帮助各位小伙伴顺利实验，少走弯路。

感染慢病毒前的细胞准备：

首先感染前确保细胞未收到污染。感染时的细胞密度过高或者过低都会影响感染效率，根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。

针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30～50%左右

针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70～80%左右

针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

感染前预实验摸索MOI：

MOI（MultiplicityofInfection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。

举个例子，取MOI=3、10、30、100，根据操作说明，将换算好体积的病毒液加入细胞中。

每孔加病毒量（µl）=MOI*细胞数/滴度（TU/ml）×1000

*可在【汉恒生物】微信公众号使用病毒体积计算器进行计算

感染3-4天后，观察荧光表达情况，通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。

病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡？

首先，确定细胞或病毒是否有污染；其次，确定病毒感染MOI值是否过高，调整MOI值，并在感染后的4 h、8 h和12 h对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液；排除以上因素后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。

如何提高病毒对细胞的感染效率？

病毒对细胞的感染效率受多个因素影响，如病毒活性、细胞自身的状态、MOI值、感染时间等。

（1）首先在病毒感染前，需要确保细胞状态良好。

（2）病毒需要避免反复冻融，解冻病毒需要在冰上进行。另外如果病毒保存超过半年需要重新测定滴度。

（3）建议您进行MOI梯度摸索实验，找出最优的MOI进行感染，在感染时可以使用汉恒生物推荐的1/2小体积感染法（详见病毒操作手册）。

（4）感染时间也至关重要，换液时间太早或太晚都会对感染效果产生影响，请您根据病毒操作手册，确定好病毒换液时间（慢病毒一般24h换液，腺病毒一般6-8h换液）。

（5）可以加入polybrene助转染试剂，增加感染效率。

（6）对于悬浮细胞可以通过平角离心感染法来增加感染效率，即加入病毒液后，放入平角离心机低速（200xg）离心1h；对于极难感染的细胞，可采用多次感染的方法。

为什么过表达的病毒感染后观察荧光比对照要暗？

基因的插入会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。对照病毒或干扰病毒，由于没有插入基因或者插入基因非常短，荧光通常较强。而插入了较长基因之后，荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱，尤其是出现高GC\片段，由于影响了转录，荧光强度会大大降低。

siRNA干扰效果好，但包装成干扰病毒后下调效果不理想？

对于干扰的病毒，是将shRNA构建到病毒载体。siRNA和shRNA在结构上并不一样，siRNA为化学合成，使用浓度一般为5uM，浓度较高，在细胞转染效率尚可情况下，瞬时进入细胞中的分子数超过10^8，且不需要经过剪切加工就可和靶点结合。

shRNA则是将干扰基因克隆到DNA上，经过病毒整合（慢病毒）或非整合（腺病毒/腺相关病毒）进入到细胞后，转录形成发夹RNA，在经过一系列酶的剪切加工，才形成可以和靶点结合的干扰RNA。这个过程中因为拷贝数低，转录加工过程复杂，会导致干扰效果不理想。