Cell Metabolism (IF=29) |科学家揭示生酮饮食诱导体重减轻的主要机制

肥胖（Obesity）是体内脂肪积聚过多而呈现的一种状态，其增加了代谢性疾病、心血管疾病甚至癌症等疾病发生的风险，对人类健康产生了巨大的威胁。生酮饮食（Ketogenic Diet，KD）是一种高脂肪、蛋白质适中和极低碳水化合物（或无碳水化合物）的饮食，在这种饮食条件下，机体的主要供能方式由葡萄糖代谢转变为脂肪代谢，由脂肪在肝脏中产生的酮体为全身供能。这种饮食方式被证明可以有效替代饮食限制来进行减肥，并且得到广泛推广，但其具体的机制尚不清楚。

生长分化因子15(GDF15)是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员，在20世纪90年代末被首次发现。研究显示，在致肥胖条件下通过转基因过表达GDF15或重组GDF15给药可改善代谢参数，促使其成为预防和治疗肥胖的新靶点，并且GDF15的一个特征是抑制食物摄入，而KD饮食的动物食物摄入量减少，表明GDF15与KD的肥胖管理之间存在潜在联系。

2023年12月5日，西北农林科技大学吴江维团队和西京医院李晓苗团队联合在Cell Metabolism上在线发表了题为“GDF15 is a major determinant of ketogenic diet induced weight loss”的研究论文。该研究发现KD饮食可以抑制人、猪和小鼠的能量摄入和减轻其体脂肪量，诱导血浆GDF15的轻微升高。并且，作者通过使用GDF15缺陷型（GDF15-/-）小鼠以及GDF15受体GFRAL缺陷型（GFRAL-/-）小鼠为实验动物，发现了GDF15-GFRAL信号轴对KD的减重作用至关重要。同时通过用AAV8-GDF15-shRNA和AAV8-PPARγ-shRNA敲低小鼠肝脏中GDF15和PPARγ的表达，消除了KD对肥胖的管理作用，进而证实了KD诱导的GDF15来源于肝脏PPARγ的激活。另外，在肝脏PPARγ敲除小鼠中，血浆GDF15水平降低，KD饮食对肥胖管理的有益作用大大减弱，而注射AAV8-GDF15-overexpression或重组GDF15蛋白可以恢复KD对肥胖的管理作用。研究结果首次揭示了GDF15在KD饮食管理体重中发挥着不可或缺的作用，增加了对KD饮食发挥代谢调控作用的理解。

值得注意的是，在本研究中，作者使用了汉恒生物提供的AAV8-GDF15-shRNA和AAV8-PPARγ-shRNA病毒，成功敲低了小鼠肝脏中GDF15和PPARγ的表达。

下面，我们一起来了解具体的研究内容：

为了探究KD饮食对于肥胖管理的作用，作者首先给肥胖的小鼠进行KD饮食或者高脂（HFD）饮食15天，结果发现从第6天开始KD组体重逐渐下降，而HFD组体重逐渐升高；并且从第3天开始，KD小鼠的累计能量摄入(kcal)减少了16.48%，血浆GDF15增加了2倍。为了进一步验证KD是否特异性诱导GDF15的表达，作者给予小鼠几种常见的肥胖管理饮食，同时又设计了两种禁食方案：每隔一天禁食和限时禁食，并测量小鼠血浆中GDF15的浓度，结果显示，这些类型的饮食在测试时间内并不能提高小鼠血浆GDF15的水平。为了进一步验证KD与GDF15的联系，作者以小型猪为实验动物，进行KD饮食。研究结果显示，在KD饮食处理15天后，KD处理组的猪体重下降，血浆GDF15水平升高；此外，作者招募了一组肥胖患者进行为期2周的KD干预，研究结果显示，在干预结束后，患者的体重显著降低，并且血浆GDF15水平显著升高。这些结果表明KD饮食降低了体重，增加了血浆GDF15的水平。

图1 KD饮食减轻体重，升高血浆GDF15的水平

接下来，为了探究GDF15在KD饮食减轻体重中发挥的作用，作者对GDF15缺陷型（GDF15-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠同时进行30天的KD饮食或HFD饮食处理，研究结果显示，30天的KD饮食显著增加了WT小鼠血浆GDF15的水平，而GDF15-/-小鼠中血浆GDF15水平没有变化；同时，与HFD饮食（对照组）比较，KD饮食降低了WT小鼠的累计能量摄入量和体重，对GDF15-/-小鼠没有影响；但是，与WT小鼠比较，KD饮食反而增加了GDF15-/-小鼠的体重。与对照组相比，KD饮食降低了WT小鼠的脂肪、肝脏质量以及血浆甘油三酯（TG）、谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和肝脏中TG含量，但GDF15-/-小鼠中没有发现类似的结果。此外，与对照组相比，KD饮食改善了WT小鼠胰岛素敏感性以及葡萄糖耐量，而GDF15-/-小鼠并没有表现出这些变化。这些结果表明GDF15对于KD饮食介导的肥胖管理是不可或缺的。

图2. GDF15对于KD饮食减轻体重是必需的

之后，为了进一步验证血浆GDF15的升高是否有助于KD饮食对肥胖管理的效果，作者用外源性重组GDF15蛋白干预小鼠，7天后将GDF15干预的小鼠分成2组，一组接受IgG处理，一组接受GDF15中和抗体处理。研究结果显示：GDF15中和抗体降低了WT小鼠的累计能量摄入量和体重。并且，与HFD饮食（对照组）比较，IgG处理的KD饮食小鼠体重减轻，而利用GDF15中和抗体处理后，KD饮食小鼠的体重开始荒蛮上升，这表明，GDF15直接介导了KD饮食引起的减重效应。

此外，作者在GDF15受体GFRAL缺陷型（GFRAL-/-）小鼠中也进行了相同的实验，研究结果显示：不管在野生型小鼠还是在GFRAL-/-小鼠中，KD饮食均会增加血浆GDF15的水平，但是在GFRAL-/-小鼠中，KD饮食对小鼠的累计能量摄入量、体重、脂肪质量、肝脏质量、血浆ALT、血浆AST和肝脏中TG含量均无明显影响；此外，在GFRAL-/-小鼠中，KD饮食对小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的改善作用也未体现。这些结果表明GDF15-GFRAL信号在小鼠KD饮食的有益代谢作用中起着重要作用。

图3 GFRAL对于KD饮食减轻体重是必需的

为了测试能量摄入的减少或能量消耗的改变是否有助于KD饮食管理肥胖，作者对小鼠按能量进行配对饮食，研究结果显示配对饮食在很大程度上消除了KD饮食和HFD饮食小鼠之间的体重差异。接着，作者对KD饮食和HFD饮食的GDF15-/-小鼠和WT小鼠使用间接测热法，以确定能量消耗是否存在额外的影响。通过协方差分析（ANCOVA），以瘦体重为协变量，分析结果显示，KD饮食的小鼠无论GFD15是否存在，其能量消耗都高于HFD对照组。以上实验结果表明，KD饮食介导的肥胖管理既包括GDF15调节的能量摄入，也包括独立于GDF15的能量消耗。

另外，有研究报道，KD饮食可增加小鼠血浆FGF21的水平，这是一种已知的可增加能量消耗的因素。因此，作者测量了血浆中FGF21的水平，发现KD饮食的WT小鼠和GDF15-/-小鼠的FGF21水平升高，其肝脏中FGF21 mRNA水平也升高。为了探究KD饮食下独立于GDF15的能量消耗是否与FGF21有关，作者用FGF21中和抗体处理KD饮食的GDF15-/-小鼠和WT小鼠，结果显示HFD饮食和KD饮食的小鼠之间的能量消耗不存在差异，结果表明FGF21是KD饮食下能量消耗增加的原因。并且，FGF21中和抗体能消除HFD饮食的GDF15-/-小鼠和KD饮食的GDF15-/-小鼠的体重差异。这些实验结果表明KD饮食的肥胖管理的作用是通过协调GDF15介导的能量摄入抑制和FGF21介导的能量消耗而实现的。

之后，为了探究KD饮食诱导的GDF15主要来源于哪个组织，作者检测了肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌、回肠和结肠组织中GDF15基因的表达水平。与对照组比较，KD干预的小鼠肝脏中GDF15 mRNA和蛋白的水平显著增加（同时，KD饮食的猪肝脏中GDF15 mRNA的表达明显增加）；为了进一步探究KD是否能在体内诱导肝脏GDF15的产生，作者使用AAV8-GDF15（AAV8-GDF15-shRNA）敲低小鼠肝脏中GDF15的表达，研究结果显示，KD饮食不能显著增加AAV8-GDF15小鼠血浆中GDF15的水平，表明HD饮食诱导了肝脏GDF15的产生；并且，肝脏GDF15下调后，KD饮食对能量摄入的抑制作用、体重减轻和减脂效果明显降低。此外，在AAV8-GDF15小鼠中，KD对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的改善作用消失，即KD饮食和HFD饮食小鼠表现出相当水平的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。以上结果表明，肝脏是KD饮食诱导GDF15产生的主要部位。

图4.KD饮食诱导的血浆GDF15主要来源于肝脏

接着，为了进一步探究KD饮食诱导GDF15的分子机制，作者对HFD和KD饮食的小鼠肝脏做了RNA-seq分析。KEGG通路分析显示，差异表达基因在多种信号通路中富集，其中包括PPAR信号通路及其靶基因在内的15个基因（Pparg、Cd36、Pltp、Cyp4a14、Slc27a1、Me1、Scd1、Cyp8b1、Cyp4a10、Cyp4a12b、Cpt1b、Acaa1b、Ehhadh、Acox1、Cyp4a12a）在KD饮食后显著上调，并且qPCR结果分析也证实了以上结果。接着，对小鼠肝脏中PPAR的成员（PPAR是核受体亚家族，有三个成员：PPARɑ、PPARγ和PPARβ/δ）进行检测，发现只有PPARγ mRNA和PPARγ蛋白的表达显著增加。并且，跟对照组比较，KD饮食的猪肝脏中PPARγ mRNA也显著增加。这些结果表明，PPARγ和GDF15之间可能存在相关性。之后，作者对GDF15启动子序列进行分析，筛选到4个可能的PPAR响应元件，并且双荧光素酶报告基因检测实验显示在小鼠正常肝细胞AML12中，PPARγ的表达能够激活GDF15启动子的转录活性。Chip-qPCR和双荧光素酶报告基因检测实验结果表明，PPARγ作为转录因子通过与GDF15启动子结合促进GDF15的转录和表达。为了进一步确定肝细胞是否能够响应PPARγ并促进GDF15的表达，作者用PPARγ的激动剂罗格列酮培养小鼠正常肝细胞AML12，结果显示，AML12细胞经过罗格列酮处理后，细胞中GDF15 mRNA表达升高，同时细胞上清中GDF15的水平也升高；并且，在AML12细胞中过表达PPARγ，也出现了类似的结果。同样，在人原代肝细胞中，罗格列酮处理或者PPARγ过表达均显著增加了细胞中GDF15 mRNA表达升高和细胞上清中GDF15的水平。此外，鉴于PPARγ在脂肪细胞中高度表达，作者进一步研究了脂肪PPARγ是否以与肝脏相似的方式发挥作用。作者对脂肪细胞3T3-L1进行了相同的处理（罗格列酮处理或过表达PPARγ），然而并没有检测到类似肝细胞或上清中GDF15的表达变化，进而排除了脂肪细胞中GDF15转录和产生的类似调节机制。此外，有研究表明肝脏整合应激反应（integrated stress response ISR）上调GDF15的表达。因此，作者通过检测ISR的关键转录调控因子ATF4和CHOP的肝脏蛋白水平进而研究KD饮食诱导的GDF15表达是否与ISR激活有关，结果显示，KD饮食小鼠中ATF4和CHOP的蛋白水平和HFD对照中的水平相似，进而排除了ISR在肝脏GDF15产生中的潜在作用。这些实验结果表明PPARγ以肝细胞特异性的方式上调GDF15的表达。

图5 肝脏而非脂肪组织中的Pparγ上调GDF15的表达

为了进一步探究PPARγ和GDF15在肝脏中的联系，作者使用AAV8-PPARγ-shRNA敲低小鼠肝脏中PPARγ的表达。与AAV8-scramble对照组比较，AAV8-PPARγ-shRNA小鼠经过KD饮食后，肝脏GDF15 mRNA的表达和分泌明显减少；并且肝脏PPARγ基因敲低后，KD饮食对体重管理的作用也明显减弱。此外，作者在肝脏特异性PPARγ基因敲除（PPARγ△Hep）小鼠中也测试了KD饮食对体重管理的作用，结果显示，KD饮食能诱导WT小鼠分泌GDF15，但在PPARγ△Hep小鼠中没有发现类似的效果，并且，在PPARγ△Hep小鼠中，KD饮食对能量摄入的抑制作用和脂肪量的减少效应消失。相同的，KD饮食显著降低了WT小鼠血浆TG、肝脏脂质含量和肝脏重量，而在PPARγ△Hep小鼠中没有发现类似的变化。此外，随着肝脏中PPARγ基因的缺失，KD饮食对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的改善作用也随之消失。以上实验结果表明，肝脏PPARγ是KD饮食对肥胖管理的关键分子。

图6 肝脏PPARγ缺失小鼠血浆GDF15水平降低，且KD饮食对肥胖管理的效果消失

最后，为了探究KD饮食在PPARγ△Hep小鼠体内肥胖管理作用的消失是否是因为肝脏GDF15表达和血浆GDF15水平的下降引起的，作者进行了挽救实验，利用AAV8-GDF15-overexpression（AAV8-GDF15-OE）在肝脏中特异性过表达GDF15。与对照组（注射AAV Vector）比较，肝脏过表达GDF15可以显著增加小鼠血浆GDF15的水平，并且恢复了KD饮食对PPARγ△Hep小鼠肥胖管理的作用（抑制能量摄入、减轻体重、减轻脂肪量、恢复PPARγ△Hep小鼠葡萄糖耐量、降低肝脏TG含量）。随后，作者进一步通过给小鼠注射重组GDF15蛋白，观察GDF15是否能恢复KD饮食对PPARγ△Hep小鼠的肥胖管理作用。结果显示重组GDF15能有效地恢复KD饮食对PPARγ△Hep小鼠肥胖管理的作用。

图7 肝脏GDF15过表达或重组GDF15可恢复KD饮食对PPARγ△Hep小鼠肥胖管理的作用