非编码RNA干货-circRNA的调控

上一期干货内容针对lncRNA进行了详细的介绍，本期继续为大家介绍既是功能性RNA分子，部分也具有编码蛋白能力的另一类非编码RNA，即本期的主角—circular RNAs（circRNAs）。

circRNAs是一类单链环状的非编码RNA，在病毒、植物和哺乳动物等各物种中广泛表达。区别于传统的线性RNA，circRNA不具有5‘帽子结构和3‘ poly(A)尾，并以共价键的形式闭合成环，对核酸外切酶不敏感，这种独特的结构赋予了circRNA高度的稳定性。

起初发现的少量circRNA，被认为是基因转录剪切过程中因剪接错误产生的一些副产物，不确定在生物学过程中是否发挥重要作用。随着高通量测序技术的应用发展，人们发现哺乳动物细胞中存在大量的circRNA。直到2013年，Nature杂志的两篇研究论文取得了突破性研究进展，首次证明circRNA可以通过充当miRNA海绵，参与基因表达调控而发挥生物学功能，进而迅速成为生物医学研究领域的焦点。我们本期将从circRNA分类及成环机制、circRNA生物学功能、circRNA常规研究思路及方法和常用数据库等方面带大家具体了解一下circRNA的“神秘”。

一、circRNA分类及成环机制

RNA的选择性剪接是真核细胞中基因转录表达过程的重要事件。mRNA前体经过剪接后将内含子去除，使外显子依次连接或跳跃式连接产生成熟的mRNA。CircRNA是mRNA前体经反向剪接产生，由下游剪接受体与上游剪接供体连接形成共价闭环结构。随后，主要可产生三种类型的circRNA：

图1. circRNA成环机制示意图^[1]

（BP：branch point，分支点；SA：splice-acceptor，剪接受体；SD：splice-donor，剪接供体；BSJ：backsplice junction，反向连接点）

1、由外显子构成的circRNA（exonic circRNA，EcircRNA）

目前研究认为EcircRNA有两种形成方式：套索驱动环化，内含子配对驱动环化。

① 套索驱动环化：这种环化方式是mRNA前体首先经过经典剪接作用和外显子跳读，生成具有多个外显子且包含内含子套索的线性RNA，然后经反向剪接，即内含子套索下游3’端的剪接受体与上游5’端的剪接供体连接成环，并将内含子切除后形成成熟的circRNA。

② 内含子驱动环化：内含子驱动环化也有两种方式。一是依赖外显子两端的内含子中具有一定长度的互补序列，经互补配对后，拉近了两端的剪接受体和剪接供体，此时内含子被切除，脱落的外显子连接成环；这是促进外显子环化的有效方法，短散在重复序列（SINE）家族成员Alu元件已明确是可促进circRNA成环，且已作为成环元件广泛应用于外源性表达circRNA。二是通过RNA结合蛋白（RBP）驱动环化，当外显子两端的内含子序列具有RBP结合位点时，RBP与之结合后形成二聚体，使两个剪接位点靠近，从而促进环化。

2、由内含子构成的circRNA（intronic circRNA，ciRNA）

ciRNA的形成过程与EcircRNA不同。正常情况下，经典剪接过程中释放的内含子套索会被降解；然而当其5’端剪接位点包含一段7nt富含GU碱基的序列以及3’端附近含有11nt富含C碱基的序列，使内含子套索受到保护，即会形成ciRNA。

3、外显子和内含子组合形成的circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）

事实上，套索驱动和内含子驱动环化不仅可以产生EcircRNA，也可能会产生EIciRNA。

除此之外，tRNA和病毒RNA等也可环化产生circRNA。

二、circRNA生物学功能

从“垃圾”到明星分子，circRNA的功能得到不断发掘，circRNA不仅具有调控功能，部分还有其独特的翻译能力，且广泛参与机体的生理和病理机制。

图2. circRNA功能示意图^[2]

1、充当miRNA海绵

起初观察到一些circRNA有许多miRNA结合位点，后来大量研究证实了这一点。位于细胞质中的circRNA可以充当竞争性内源RNA（ceRNA），吸附miRNA发挥生物学功能。

2、circRNA翻译功能

真核细胞中mRNA通过5’端帽子结构附着到核糖体上，最终翻译出多肽。circRNA缺乏5’帽子，无法依赖这种方式进行启动翻译，但是含有内部核糖体进入位点（IRES）的circRNA可以直接募集核糖体并起始翻译，此类circRNA需同时拥有开放阅读框（ORF）且位于IRES下游。

3、转录调控功能

circRNA可以通过与相应DNA位点结合形成RNA－DNA杂交链或R环，导致结合处无法转录，发生外显子跳跃或转录终止，进而产生新的剪切体。另一方面，circRNA也可与转录因子相互作用以调节基因转录。

4、circRNA与蛋白质相互作用

除上述功能外，circRNA还可以与一种或多种蛋白相互作用，充当蛋白诱饵、支架或募集剂。具体而言，circRNA与蛋白结合可能产生多方面的影响：

① 改变蛋白间或蛋白与核酸分子的相互作用：一种模式是circRNA同时与两种蛋白相互作用，促进或解离这两种蛋白的互作；另一种模式是circRNA通过与一种蛋白相互作用，来影响该蛋白与另一蛋白的互作；还有一种则是circRNA只与一种蛋白结合，使其功能丧失或产生新的功能。

② 募集蛋白到染色质中：circRNA与顺式作用元件结合并招募转录因子或表观遗传修饰酶等，进而改变基因表达。

③ 改变蛋白的核内外分布：核定位或胞质中可入核的circRNA可促进蛋白的核易位，胞质定位或核内可输出到胞质中的circRNA则促进蛋白的胞质易位；此外还有部分可转运至膜或线粒体等。

三、circRNA常规研究思路及方法

从上一小节可知，目前发现circRNA发挥作用的功能机制分类繁杂，其中以ceRNA相关机制研究为主。这里总结了circRNA的一般研究思路尤其是ceRNA机制，以及对应的一些研究方法，供大家参考（图3）。

值得注意的是，与普通线性基因不同，circRNA的表达调控有其特别之处。

（1）circRNA过表达：内源性circRNA之所以能闭合成环，是因为circRNA序列外显子两侧的长侧翼内含子具有成环元件（如Alu），能够促进线性序列成环。因此使用质粒或病毒载体进行外源性表达，同样需要在circRNA序列两端加上成环元件，以确保序列成环。

（PS：汉恒生物circRNA成环载体系统可达到100%成环哦，且体内和体外实验均适用。）

（2）circRNA干扰：siRNA或shRNA即可用于敲低circRNA，但为避免干扰到其母本基因或线性序列的表达，需针对circRNA的接点处设计干扰靶点。

（3）circRNA敲除：使用CRISPR-Cas9技术敲除circRNA。考虑可能会影响到亲本基因的表达，一般是不会直接敲除circRNA的片段。通常采取敲除circRNA的成环元件Alu的方式，破环其成环能力，即针对circRNA两端长侧翼内含子中的Alu序列设计双gRNA进行敲除，此法难点在于内含子中可能存在不止一个Alu元件，需从中找出催化成环对应的序列。

图3. circRNA研究思路及相关方法

四、常用数据库

要想研究circRNA机制，通过数据库进行信息查询或预测相关功能是必不可少的，下面是一些circRNA研究常用到的数据库，可以查询circRNA的基本信息、互作靶点、与之相关疾病以及预测编码能力等（表1）。

表1. circRNA常用数据库汇总

本期内容从circRNA的分类、成环机制、主要生物学功能、研究思路及方法这几个方面进行了具体介绍，希望能帮助到想入门研究circRNA或涉及相关研究方向的小伙伴，有兴趣可以根据这些知识点深入拓展哦~另外，汉恒生物可以提供circRNA过表达、干扰和敲除载体的构建、与靶基因互作的双荧光素酶验证服务等，并拥有专业的技术服务团队为您答疑解惑，有意向的小伙伴欢迎与我们联系~下期我们将继续介绍另一种重要的非编码RNA—microRNA，敬请关注！

参考文献：

[1] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019 Nov;20(11):675-691. doi: 10.1038/s41576-019-0158-7.

[2] Li R, Jiang J, Shi H, Qian H, Zhang X, Xu W. CircRNA: a rising star in gastric cancer. Cell Mol Life Sci. 2020 May;77(9):1661-1680. doi: 10.1007/s00018-019-03345-5.