非编码RNA干货-LncRNA的生物学调控

上一期内容为大家介绍了非编码RNA调控概述 ，本期将从LncRNA的简介分类、功能、常用数据库、研究思路及功能调控等为大家详细介绍非编码RNA调控系列之LncRNA的调控。

一、LncRNA的简介及分类

1、LncRNA的简介

长链非编码RNA（Long non-coding RNA, LncRNA），一般指基因长度大于200nt的长链非编码RNA的统称。LncRNA主要是RNA聚合酶II转录的副产物，最早被认为基因组转录中的“噪音”片段，因此被认为不具有生物学功能。然而近年研究中发现，LncRNA是真核生物生命活动的重要组成部分^[1]。LncRNA在1991年首次被证实参与X染色体沉默，随后被证实具有染色质修饰、转录调控、ceRNA调控等多种调控过程，LncRNA的调控作用也开始成为近年来研究的热点。

2、LncRNA的分类

LncRNAs一般可根据其自身结构、定位、功能或与DNA/RNA/蛋白互作功能进行分类。我们今天主要介绍通过其相对于附近蛋白质编码基因的基因组位置^[2]，LncRNAs可分为：

1) 正义LncRNAs：与邻近蛋白编码基因转录方向相同，与编码基因的一个/多个外显子重叠；

2) 反义LncRNAs：与邻近蛋白编码基因转录方向相反，与相反链上的转录产物部分或完全互补；

3) 内含子LncRNAs：来源于编码基因的内含子，由基因的内含子转录产生；

4) 基因间LncRNAs：由编码基因之间的序列独立转录；

5) 双向LncRNAs：可同时从与邻近蛋白编码基因转录方向相同和相反2个方向发生转录；

6) 增强子LncRNAs：由蛋白质编码基因的增强子区域产生。

图1. LncRNA基因组位置分类^[3]

二、LncRNA的相关功能介绍

LncRNA不只是基因组中的承接序列，更多是承担了各种DNA、RNA及蛋白间调控功能的重要遗传信息。LncRNA发挥功能主要依靠其二级结构，与蛋白质结合，可引起染色质重构、转录功能调控等。还可以通过ceRNA竞争机制，与靶基因mRNA竞争性结合miRNA，间接影响靶基因表达量。也可以通过与编码蛋白基因的mRNA形成互补链，影响其剪切或翻译结果。因此LncRNA的生物学功能明确了许多基因组复杂性表达调控的难题，接下来我们详细的探索下LncRNA的主要功能：

图2. LncRNA基因功能^[3]

1、LncRNA表观遗传学调控

1）LncRNA可以通过RNA-DNA或RNA-染色质相互作用，发挥表观遗传学调控功能。

2）LncRNA可以是染色质重塑蛋白打开或关闭染色质的支架。LncRNA通过共价修饰途径直接与组蛋白或DNA修饰酶相互作用；也可以通过非共价调控，依赖ATP调控染色质重塑。

2、LncRNA转录翻译调控

1）LncRNA可以通过顺式/反式调节影响成熟mRNA的稳定性、差异剪接、修饰的编辑等。

2）LncRNA可以通过在翻译过程中与核糖体或mRNA转录物结合来调节mRNA的翻译。

3）LncRNA可以是转录因子激活/抑制的支架，其与转录因子的作用调控主要体现在LncRNA与蛋白的互作。由于LncRNA较长，确定LncRNA的作用区域是研究LncRNA-蛋白互作机制的关键步骤。

3、ceRNA机制调控

LncRNA通过碱基互补配对原则结合miRNA种子区域序列竞争性地吸附miRNA，从而阻断miRNA与下游靶基因的结合，进而影响下游靶基因表达量的变化。作为竞争性内源性RNA，LncRNA可以导致miRNA功能的丧失或降低，并影响miRNA对靶基因的调控作用。

4、LncRNA编码蛋白

LncRNA一般被认为在转录本中缺少开放阅读框，不能被翻译成蛋白质。但2011年，发表在 《Cell 》上的文章表明LncRNA可以被核糖体吸引，并通过检测翻译效率相关的数值，证明了其中一些LncRNA具有翻译产生小肽的能力^[4]。在2020年的一篇研究中，研究团队使用了众多的宏观组学的分析，包括ribosome profiling、mass spectrometry (MS)-based proteomics、microscopy以及 CRISPR-based genetic screening等方法^[5]，证明了在人类的细胞中数百个LncRNA能表达出稳定的微肽，并参与细胞的生命活动。研究揭示了编码微肽与功能性调控RNA均可作为LncRNA的功能，发挥作用并不冲突。

三、LncRNA常用数据库

了解LncRNA功能后，我们应该通过强大复杂的LncRNA数据库进行相关信息或相关预测的查询，下面是一些LncRNA研究常用的数据库汇总，可以对应查询到LncRNA的基因信息、亚细胞定位、SNP位点、编码能力及相关疾病等（表1）。

表1. LncRNA常用数据库

四、LncRNA的研究方案

熟悉了LncRNA的相关功能和常用数据库后，就可以针对LncRNA展开具体的实验研究。LncRNA的研究思路主要分为三大部分：LncRNA靶点筛选、LncRNA功能研究以及LncRNA相关的机制研究，下面我们针对LncRNA的研究方案进行具体说明。

图3. LncRNA研究思路导图

1、LncRNA靶点筛选

LncRNA靶点筛选需要先通过生物信息学分析、RNA-seq以及芯片技术等对疾病模型/病例样本进行LncRNA表达谱分析，用来发现和筛选差异性表达的LncRNA，并在疾病模型组织中进行验证确认。由于LncRNA核定位概率较高，因此功能研究前建议确认LncRNA的亚细胞定位。

1）LncRNA发现与筛选

LncRNA筛选主要通过高通量LncRNA芯片、直接测序或生物信息学分析方法筛选差异表达的LncRNA，也可以通过生物信息学预测共表达网络中相关的LncRNA靶点，进而确认其上下游及关联基因。

2）LncRNA差异表达验证

通过QPCR方法检测相关疾病模型组织或细胞中，LncRNA差异性表达及其本底表达情况，制定后续对应的功能研究方案。

3）LncRNA亚细胞定位

LncRNA较细胞质定位更多的是呈现出明显的细胞核定位状态。除了现有数据库查询和分析方式，一般需要通过FISH实验对LncRNA亚细胞定位进行辅助验证。

定位在细胞核的LncRNA，可以与细胞核内的DNA、RNA、蛋白质等分子相互作用，实现染色质重塑、mRNA剪接、转录调节等调控功能；

定位在细胞质的LncRNA，多在转录后水平实现对编码基因的调控，调节mRNA翻译或降解等，也可以参与细胞内复杂的信号通路网格的调控。

2、LncRNA的功能研究

筛选出差异表达的LncRNA，并利用QPCR、FISH等技术，检测LncRNA在细胞/组织中的分布和表达量变化。接下来需要通过过表达、敲低、敲除等调控方式来改变LncRNA的表达量，再通过观察细胞和动物模型中相关功能的变化，来明确LncRNA的生物学功能。

1）LncRNA的过表达调控

将全长LncRNA合成并构建至非病毒载体（质粒、体外合成等）或者病毒载体（慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等）上，以实现LncRNA的过表达调控。样本组织中的表达水平：检测不同组织以及不同阶段的表达水平；细胞水平上的表达：检测不同细胞中，LncRNA的表达水平。

2) LncRNA的敲低调控

敲低LncRNA的方式主要分为三类：a. 直接合成ASO；b. 直接合成siRNA靶点；c. 质粒载体或者病毒载体表达shRNA 。研究LncRNA敲低调控时，首要考虑其亚细胞定位情况，据文献报道[6]，针对于细胞核定位的LncRNA，使用ASO明显比siRNA起到更好的干扰效果；针对于细胞质定位的LncRNA，siRNA发挥出了更明显的干扰调控优势；而对于细胞核和细胞质同时定位的LncRNA，单独使用siRNA或ASO都没有前面两种效果好，但联合使用siRNA和ASO却能达到更好的敲低效果。

图4. LncRNA敲低工具效果对比图^[6]

3）LncRNA的敲除调控

针对于编码基因的敲除，非3倍数碱基的插入/缺失会导致移码突变，编码提前终止等现象，实现编码基因的敲除，但这些通过影响编码基因正确编码的手段并不能对LncRNA达到敲除效果。因此，要想实现LncRNA的敲除调控，则需要在基因组上LncRNA上下游各设计1个sgRNA，通过片段敲除的方式，实现LncRNA敲除的效果。

图5. LncRNA敲除sgRNA位置^[7]

3、LncRNA的机制研究

1）LncRNA与DNA/RNA互作

RNA与DNA可以通过碱基互补配对形成RNA-DNA杂合链，这种互作形式对于细胞生命活动维持与遗传信息调控具有重要生物学意义。综述研究表示，RNA-DNA互作鉴定方法分为三种^[8]：a. 针对特定RNA的互作DNA鉴定：使用与目标RNA互补配对的探针进行pulldown，将富集到的DNA进行测序鉴定；b. 针对所有RNA-DNA互作的鉴定：采取两种捕获策略，一种是使用嵌合的RNA/DNA双接头，可以同步实现RNA和DNA的捕获；另一种为分别捕获互作的RNA和DNA；c. 针对特定DNA位点的RNA-DNA互作鉴定：采用dCas9策略富集与特定DNA区域互作的RNA。

LncRNA与RNA互作可以通过RNA pulldown、CHIRP等实验方法。设计与目标RNA序列反向互补的生物素探针，把目标RNA拉下来以后，则与其共同作用的RNA片段会被间接富集到链霉亲和素磁珠上，最后通过qRT-PCR或测序来测定目的RNA。

2）LncRNA与蛋白互作

RNA pull down是用于检测LncRNA结合蛋白与LncRNA互作的主要实验方法。通过体外转录法标记生物素RNA探针，并与胞浆蛋白提取液共孵育，形成RNA-蛋白质复合物。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的LncRNA结合蛋白是否与LncRNA相互作用。

3）ceRNA机制

通过网络数据库miR CODE、LNCBase等预测LncRNA-miRNA-mRNA轴上相关的靶基因。确定靶基因后，通过miRNA的种子序列或自由能结合方式进行miRNA与LncRNA可能结合位点的预测，并通过双荧光素酶实验进行验证。

本期内容针对LncRNA的简介分类、功能、常用数据库、研究思路及功能调控等四大方面进行了详细介绍，希望对LncRNA研究方向的小伙伴可以有所裨益。汉恒生物可以提供LncRNA过表达/干扰/敲除载体的构建、以及LncRNA与miRNA/靶基因互作的双荧光素酶验证服务等，并拥有专业的技术服务团队为您答疑解惑，有意向的小伙伴欢迎与我们联系~下期我们将继续为大家介绍另一种重要的非编码RNA—circRNA，敬请关注！

参考文献：

[1]   Lee JT. Epigenetic regulation by long noncoding RNAs. Science (New York, NY). 2012; 338(6113): 1435-1439.

[2]   Hermans-Beijnsberger S, van Bilsen M, Schroen B. Long non-coding RNAs in the failing heart and vasculature. Noncoding RNA Res. 2018 Apr 14; 3(3): 118-130.

[3]   Robinson EK, Covarrubias S, Carpenter S. The how and why of lncRNA function: An innate immune perspective. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2020 Apr; 1863(4): 194419.

[4]   Ingolia NT, Lareau LF, Weissman JS. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 2011 Nov 11; 147(4): 789-802.

[5]   Chen J, Brunner AD, Cogan JZ, et al. Pervasive functional translation of noncanonical human open reading frames. Science. 2020; 367(6482): 1140-1146.

[6]   Lennox KA, Behlke MA. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2016 Jan 29; 44(2): 863-77.

[7]   Han J, Zhang J, Chen L, Shen B, Zhou J, Hu B, Du Y, Tate PH, Huang X, Zhang W. Efficient in vivo deletion of a large imprinted lncRNA by CRISPR/Cas9. RNA Biol. 2014; 11(7): 829-35.

[8]   Li X, Fu XD. Chromatin-associated RNAs as facilitators of functional genomic interactions. Nat Rev Genet. 2019 Sep; 20(9): 503-519.