如何养好细胞之工具细胞培养及应用

工具细胞是实验或者生产中常用到的细胞株，是一类很常用的表达研究外源基因的细胞株。工具细胞通常培养条件简单，比较容易转染，应用于科研领域和工业生产。常用的工具细胞有以下几种：293细胞、CHO细胞、Vero细胞等。

一、293细胞

HEK293又称293细胞，是人胚肾293细胞。1973年，荷兰莱顿大学的Alex Van Der Eb博士和Frank Graham博士在研究人类腺病毒（Adenovirus）时培养了这种细胞，在第293次实验成功产生了原始细胞克隆，所以命名为293细胞。由于293细胞的19号染色体整合了大约4.35 kb的腺病毒基因组片段，使其细胞周期以及细胞表型、核型等发生了改变，获得永生化特性，在生产腺病毒载体和腺相关病毒载体、生产蛋白、疫苗、抗癌试剂以及细胞生物学研究上广泛应用。

到目前为止，根据不同的研究与生产需求，已经人为地建立了许多HEK293细胞的亚型和衍生细胞系，293T、293T/17、293A、AAV-293、293H、293S、293SG、293F、293FT、293FTM、293E、293-6E等，下面就来介绍这些细胞的培养及应用。

图1.HEK293细胞及其衍生细胞系起源示意图

293细胞培养条件

形态：上皮细胞样

生长特性：贴壁

生长培养基：DMEM培养基90%；优质胎牛血清，10%。

培养条件：空气，95%；CO2，5% ；37℃

冻存条件：55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO。

传代比例：1:3-1:4，1周换液2-3次

注意事项：该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基

1.293T细胞

293T细胞由HEK293细胞衍生而来，是SV40 largeT抗原稳转得到的细胞株，和HEK293细胞一样容易转染，用磷酸钙、PEI或脂质体转染，效率均可达90% 以上。其表达的SV40 largeT抗原可实现外源表达载体的扩增，最终增加目的基因的表达量。293T细胞常用于基因表达、蛋白生产慢病毒、逆转录病毒及腺病毒的包装等。

2.293T/17细胞

293T/17细胞株是293T（293tsA1609neo）细胞株的衍生株。293T细胞中共转染入pBND 和 pZAP 质粒，获得的具有G418耐受的细胞系即为293T/17细胞系。293T/17细胞持续表达猿病毒40（SV40）大T抗原，因其高转染能力筛选到17号克隆。293T/17的转染效率更高，已经成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。

3.293A细胞

293A细胞是众多293细胞系列的一个亚克隆，因其具有相对扁平的形态和良好的贴壁能力而得名（A是adhesion首字母）。该细胞含有一个稳定整合的E1基因拷贝，能够提供生成重组腺病毒所需的E1蛋白（包括E1a和E1b蛋白），故它常被用于腺病毒的初始生产、扩增和滴定。在培养过程中，该细胞呈现单层的扁平形态，没有明显的细胞重叠和细胞空隙（hole），这使得病毒滴定和空斑测定（plaque assay）更为容易。

4.AAV-293细胞

AAV-293源自普遍使用的HEK293细胞株，但用它包装腺病毒相关重组病毒产生的滴度更高。HEK293细胞是剪切过的腺病毒5型DNA转染的人胚肾细胞。跟HEK293细胞一样，AAV-293细胞反式表达腺病毒E1基因，当共转染三个AAV助质粒（一个含ITR的质粒，pAAV-RC，和E1缺失助质粒）时，可以产生有感染力的腺相关病毒颗粒。更推荐用AAV-293来包装腺相关病毒。

5.293H细胞

293H细胞是将293细胞驯化后得到的能够在无血清培养体系下快速生长、具有高转染效率及高效蛋白表达性能的细胞系。另外，该细胞系贴附力好，常用于噬菌斑检测等应用。

6.293S细胞

293S细胞是被驯化成能够悬浮培养且能够耐受低钙离子培养条件的293细胞系。

7.293SG细胞

将293S细胞用甲基磺酸乙酯诱变处理，蓖麻毒素选择后再转染pcDNA6/TR质粒得到耐受蓖麻毒素的细胞系即为293SG。该细胞系缺乏乙酰氨基葡萄糖转移酶I活性，因此可促进蛋白的Man5GlcNAc2N-聚糖型糖基化修饰。此外，该细胞系中具有四环素表达抑制基因，可用于四环素诱导的蛋白表达研究。

293SG细胞系常用于同源的N-糖基化蛋白的表达。

8.293F细胞

293F细胞是一类能够在无血清中高表达蛋白的野生型293细胞系。

9.293FT细胞

293FT细胞是在293F细胞系中插入pCMVSPORT6TAg.Neo质粒的转化细胞系，能够快速增值，易转染，能够用于慢病毒载体的生产。

10.293FTM细胞

293FTM细胞则是来源于Flp-InTMT-RETM293细胞，该细胞系中转染了ecotropic receptor质粒及MAPPIT(mammalian protein-protein interaction trap)报告质粒，该细胞系主要用于蛋白互作的筛选。

11.293E细胞

293E细胞指的是在293-H细胞中插入EBNA-1基因的细胞系，该基因能够稳定表达EBV病毒的EBNA1蛋白。含有EBV复制起点（oriP）的重组表达质粒，能够在H293E细胞中复制，并实现蛋白的高效表达。

12.293-6E细胞

293-6E细胞则是在293-H细胞中插入截短过后的EBNA-1基因的细胞系，其能够在无血清培养基中高表达生产蛋白及病毒载体。

二、CHO细胞

CHO细胞于1956年从中国仓鼠卵巢细胞中分离出来，并被发现可以无限分裂的细胞，是成纤维细胞的一种。由于该细胞存在缺少脯氨酸合成基因的遗传缺陷，因此在培养过程中需在培养基中加入l -脯氨酸才能生长。

CHO细胞因为具有可粘附或悬浮生长、易基因突变、易基因转染、可实现蛋白翻译后修饰和化学选择等特点，被广泛认为是极佳的哺乳动物基因表达宿主细胞。CHO细胞隶属于成纤维细胞，内源性蛋白分泌少，因此非常有利于靶蛋白的分离和纯化。并且CHO细胞能够在无血清悬浮培养中以高密度生长，并且在延长的发酵周期中维持高水平的蛋白质表达。市场上超过70%的蛋白质药物的首选制造细胞都是CHO细胞，CHO细胞已经成为基因工程和生物制药的重要工具。

CHO细胞培养条件

形态：成纤维细胞样

生长特性：贴壁

生长培养基：DMEM＋10% FBS＋1% P/S

培养条件：空气，95%；CO2，5% ；37℃

冻存条件：55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO。

传代比例：1:3-1:4，1周换液2-3次

CHO细胞进一步分为野生型和突变型细胞两类。工业上最常见的几种细胞系包括CHO -k1、CHO-DG44、CHO-S等。

1. CHO-k1细胞

于1957年诞生，是早期CHO细胞的亚克隆，属于接近野生型细胞。但在1968年的突变分析表明，CHO-K1细胞缺乏甘氨酸生物合成的基因。CHO-K1细胞是实验中非常常用的一个细胞株，在生物制药中使用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。

2. CHO-DG44细胞

诞生于1983年CHO-DG44也属于DHFR缺陷细胞，与CHO-DXB11不同的是，CHO-DG44有一个DHFR双缺陷，有两个位点被敲除，因此DG44可用于筛分，在工业应用上最为广泛，目前市场上70%以上的抗体药都是由CHO-DG44宿主细胞表达。

3. CHO-S细胞

1973年Thompson实验室分离了一株可以悬浮培养的CHO细胞，命名为CHO-S，可在生物反应器中大规模培养。CHO-S细胞贴壁生长及悬浮生长均可。用于蛋白表达时，应使用悬浮生长状态，此时细胞生长状态更好，生物反应器中的传质、传热效率更高，同时也可提高生物反应器空间使用效率。工业上大规模生产单抗，重组蛋白，大部分使用悬浮培养法来生产。

三、Vero细胞

Vero细胞（又称非洲绿猴肾细胞）是一种非整倍性的非洲绿猴肾细胞系，最初由日本千叶大学的Yasumura和Kawakita于1962年3月分离自正常非洲成年绿猴的肾脏上皮细胞。其被广泛应用于病毒感染分子机制研究、疫苗及重组蛋白的生产。

vero细胞培养条件

形态：上皮细胞样

生长特性：贴壁

生长培养基：MEM＋10% FBS＋1% P/S

培养条件：空气，95%；CO2，5% ；37℃

冻存条件：55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO。

传代比例：1:2-1:3，1周换液2-3次

vero细胞应用

（1）用于检查大肠杆菌毒素。大肠杆菌毒素最初就因此细胞系而被命名为Vero毒素，后来被称为志贺菌素样毒素，因为它与在痢疾志贺菌中分离出来的志贺菌素很相似。

（2）作为培养病毒的细胞宿主。比如：测定某种药物对病毒复制速度的影响，检验是否存在狂犬病毒或者为了研究目的培养病毒。

（3）作为真核寄生虫的宿主细胞，尤其是锥体虫属。

（4）用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞，是在限定代次内不致癌的异倍体细胞，WHO批准可以用于人类疫苗的生产基质。