IF=39.3丨黄芪甲苷衍生物HHQ16改善梗死性肥厚和心力衰竭

2023年10月19日，海军军医大学药学院张卫东带领的研究团队在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=39.3）杂志上发表题为《Astragaloside IV derivative HHQ16 ameliorates infarction-induced hypertrophy and heart failure through degradation of lncRNA4012/9456》的研究论文，该研究发现一种新的小分子HHQ16，它是黄芪甲苷IV的衍生物，通过直接作用于心肌细胞来逆转心肌肥厚，有效地逆转梗死诱导的心肌重构和改善心功能。在本研究中，作者使用了汉恒生物的在体研究工具产品：AAV-lnc9456，并使用了ctnt特异性启动子，用于心肌细胞中lnc9456的特异性过表达。

心肌梗死（MI）后心室重构是心力衰竭（HF）最常见的原因。心肌损伤导致负荷突然增加，从而引发神经体液级联反应，并诱发一种独特的心脏重构模式，其特征是全身扩张和远端非梗死性心脏肥厚。远端肥厚与心肌梗死后重构过程中的心功能障碍相似，是心衰发展的独立危险因素。心肌细胞大小和腔室几何形状恢复到正常的水平，心功能的改善。这一过程被称为重塑可逆性，是治疗梗死性心衰的一种很有希望的方法。

黄芪是临床上治疗慢性心衰的常用中药。黄芪的主要有效成分为黄芪甲苷。近十年来，科学证据表明，黄芪甲苷可显著逆转实验性慢性心力衰竭的不良重构，但其直接作用靶点和作用尚不清楚。因此，黄芪甲苷可能为新药开发提供有价值的候选化合物。本研究优化了一种新型黄芪甲苷小分子衍生物HHQ16，该衍生物通过直接作用于心肌细胞产生抗肥厚作用，有效逆转心肌梗死后重构，改善心功能。

下面，我们一起来了解具体的研究内容：

1. 一种新的小分子HHQ16可显著改善梗死性心衰小鼠心功能，逆转心肌重构

作者筛选出一种新的小分子衍生物HHQ16，并研究HHQ16对左冠状动脉前降支结扎(LADL)引起的HF小鼠缺血的影响。结果表明，接受10 mg/kg HHQ16治疗的小鼠左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）发生明显改善。同时，HHQ16显著降低增大后的心脏尺寸和心脏重量与体表面积之比(HW/BSA)。H&E和Masson染色显示，HHQ16通过减少细胞体积以及纤维化，显著逆转了LADL诱导的肥大。HHQ16也恢复了线粒体形态。综上所述，这些结果证明HHQ16治疗可以有效逆转LADL诱导的小鼠心功能恶化和结构重塑。

图1 HHQ16显著改善心功能，逆转心衰小鼠心肌重构

2. HHQ16直接作用于心肌细胞产生抗肥厚作用

为了研究HHQ16对HF影响的分子机制，采用RNA-seq分析了差异表达的转录本，包括蛋白编码mRNA和长链非编码RNA (lncRNAs)。作者发现，受HHQ16影响的差异mRNA主要富集于扩张型心肌病和肥厚型心肌病，以及肥厚标记物β-MHC、ANP和BNP，提示HHQ16对心脏肥厚具有突出的调节作用。LADL诱导的ANP、BNP和β-MHC的增加被HHQ16逆转。

采用异丙肾上腺素(ISO)、Ang II或苯肾上腺素(PE)刺激心肌细胞作为体外心肌肥大模型。HHQ16限制了ISO + PE刺激诱导的心肌细胞体积扩张。HHQ16还逆转了ISO刺激引起的ANP和BNP肥厚表达的增加。这些数据表明，通过HHQ16治疗，肥厚心肌细胞可以恢复到接近正常的大小，这可能是HHQ16逆转梗死诱导的重构和HF作用的原因。

图2 HHQ16通过直接作用于心肌细胞抑制心肌肥厚

3.HHQ16的作用与对lnc9456的强烈抑制有关

LncRNAs通常可以调节mRNA的表达，在生物过程中发挥着至关重要的作用，所以作者进一步分析lncRNAs测序数据，共鉴定出小鼠心脏中35个lncRNA，其中HF中12个下调lncRNA被HHQ16上调，HF中23个上调lncRNA被HHQ16下调。lnc9456是一个位于10号染色体上Egr2基因上游的GM32255基因的转录本。HHQ16显著抑制ISO、Ang II或ISO + PE诱导的原代或HL-1心肌细胞中lnc9456的高表达，说明HHQ16对心肌肥厚和HF的影响与对新的Egr2相关转录物lnc9456的强烈抑制有关。

图3 一个新的转录本lnc9456被HHQ16强烈抑制

4. Lnc9456对心肌细胞肥大至关重要

Lnc9456在正常心脏中几乎检测不到，但在LADL治疗的肥大和衰竭小鼠心脏中以及体外肥厚心肌细胞中高表达，并伴有ANP和BNP等肥厚生物标志物表达的平行增加，提示lnc9456可能是驱动心肌细胞肥厚的致病因子。为了确定lnc9456在心肌细胞肥大中的功能作用，作者还在HL-1小鼠心肌细胞中过表达lnc9456，结果发现，过表达lnc9456的心肌细胞明显增大，标志物ANP、BNP和β-MHC在转录和蛋白水平上的表达也较高。而沉默lnc9456后，ISO + PE诱导的心肌细胞肥厚作用也被消除。

图4 Lnc9456对心肌细胞肥大至关重要

5. Lnc9456与G3BP2相互作用，促进NF-κB信号通路

为探讨lnc9456对心肌细胞肥厚影响的潜在下游机制，作者使用catRAPID筛选可能与lnc9456相互作用的潜在蛋白。G3BP2与lnc9456直接相互作用的概率最高。进一步验证发现，小鼠的LADL引起G3BP2表达呈时间依赖性增加。当lnc9456的表达受到干扰时，G3BP2的蛋白水平下降；而lnc9456高表达时，G3BP2的蛋白水平相应升高。作者通过共免疫沉淀实验证实了lnc9456的过表达能够增强G3BP2与IκBα的结合，并促进NF-κB亚基p65的核聚集。

图5 Lnc9456与G3BP2相互作用，促进NF-κB p65亚基的核易位

6. Lnc9456是HHQ16逆转小鼠心脏肥厚和功能障碍所必需的

Lnc9456是促肥厚因子，而HHQ16可显著降低肥厚心脏及心肌细胞中Lnc9456的水平，提示HHQ16可能通过靶向Lnc9456实现心肌肥厚及HF的作用。作者进一步探讨HHQ16如何调控lnc9456的表达。结果显示，HHQ16显著降低了lnc9456的半衰期，并且仍然能够降低AdV -lnc9456诱导的心肌细胞中lnc9456的高表达，强烈暗示这种调节可能发生在转录后水平。为了证实这一观点，作者在体外转录系统中进一步检测了HHQ16对lnc9456稳定性的影响。HHQ16降低体外转录的lnc9456水平呈时间和剂量依赖关系。微尺度热电泳(MST)数据显示HHQ16与lnc9456具有高亲和力，但对抗肥厚lncRNA Mhrt没有任何亲和力。因此，HHQ16可以特异性结合lnc9456并促进其在心肌细胞中的降解。

图6 HHQ16直接与lnc9456高亲和力结合，诱导其降解

7. Lnc9456是HHQ16逆转小鼠心脏肥厚和功能障碍所必需的

考虑到HHQ16可以降解体外转录的lnc9456，作者进一步评估了增加的lnc9456对心脏的影响以及HHQ16在体内的作用。过表达AAV-lnc9456的小鼠心脏呈现出心肌肥厚和功能障碍。HHQ16处理可以降低心脏中lnc9456的高水平，并在心肌细胞特异性过表达lnc9456的小鼠中恢复重构相关的变化，进一步支持HHQ16通过转录后抑制lnc9456发挥作用。

同时，为了评估lnc9456功能丧失对心脏和体内HHQ16活性的影响，生成了lnc9456CKO小鼠。结果表明，HHQ16仅在lnc9456f/f小鼠中表现出抑制心肌肥厚和HF的作用，而在lnc9456CKO小鼠中没有，这表明lnc9456是HHQ16逆转心肌肥厚和HF的特异性靶点。

图7 Lnc9456是HHQ16逆转小鼠心脏肥厚和功能障碍所必需的

8. 人类同源物lnc4012是HHQ16的真正靶点

作者发现lnc9456的同源物lnc4012是HHQ16在人心脏中的靶点，并在人心肌细胞AC16进一步验证了上述的结果，证实了小鼠lnc9456和人lnc4012分子机制是一致的。而HHQ16对lnc4012的亲和力要高于小鼠同源物lnc9456，并以时间依赖性的方式促进体外转录的lnc4012的降解。在人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)中， HHQ16显著降低ISO诱导的lnc4012的表达，支持HHQ16逆转病理性肥大和HF的真正靶点。

图8 人类同源物lnc4012是HHQ16的真正靶点

综上所述，作者发现一种新的小分子HHQ16，黄芪甲苷IV的衍生物，通过直接逆转现有的心肌肥大，逆转梗死诱导的不良重构和HF。为lnc4012/lnc9456在心肌梗死诱导的肥厚和心衰发展中的作用提供了新的机制见解。研究证明lnc4012/lnc9456是一个新的小分子HHQ16的真正靶点，通过特异性结合lnc4012/lnc9456，导致其降解，并拮抗其对心肌细胞G3BP2/NF-κB信号传导的作用，有效逆转梗死诱导的肥厚和HF。小分子靶向降解病理性增加的lnc4012/lnc9456可能是一种新的有希望的治疗肥厚和HF的策略。