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Acta Pharmaceutica Sinica B|揭秘小檗碱BBR抗炎作用新靶标—EIF2AK2

2023.02.28 浏览量 来源:汉恒生物

中药作为民族瑰宝,已应用了数千年。揭示中药单体的作用靶点和作用机制,可大大提高新药的发现速度和中药的接受程度。小檗碱(BBR),与二甲双胍、阿司匹林等被并称为“神药”,药理活性广泛。除传统的抗痢疾杆菌活性外,小檗碱在II型糖尿病、高脂血症、阿尔兹海默症等方面的新生物学作用逐渐被发现和阐明。基于此,BBR的直接靶标陆续被发现,但其复杂而巧妙的网络机制尚未完全阐明,如果能阐明BBR的关键靶点,不仅有助于我们理解生物进化的本质,也能为新药的发现提供“可成药”的靶点。

2022年12月14日,中国医学科学院医药生物技术研究所宋丹青团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》(IF=14.903)发表了题为:“Discovery and identification of EIF2AK2 as a direct key target of berberine for anti-inflammatory effects”的研究论文,该团队使用全新的BBR二苯酮光亲和探针,通过基于活性的蛋白质组分析技术(ABPP)寻找抗炎的关键靶点。他们首先通过多学科交叉的手段,首次发现并验证EIF2AK2(也称为PKR)、eEF1A1、PRDX3和VPS4B作为BBR的直接靶点,发挥协同抗炎作用。其中,BBR通过离子键与EIF2AK2强结合,并通过EIF2AK2同时调控多种炎症通路,表明EIF2AK2是BBR抗炎作用的关键靶标。此外,BBR可以巧妙地抑制EIF2AK2二聚体形成而不是直接抑制其酶活性,并选择性抑制JNK、NF-κB、AKT和NLRP3等多种信号通路,具有良好的安全性。体内研究进一步证实,BBR以EIF2AK2依赖性方式抑制炎症反应,因此,抑制EIF2AK2二聚体形成可能成为治疗炎症等相关疾病的重要靶点。值得注意的是,本研究使用了汉恒生物提供的敲低EIF2KA2的腺相关病毒(AAV)。

下面,我们一起来看具体的研究结果:

首先,作者在THP-1细胞中筛选并评估了BBR靶标的荧光标记,最终选择了11b作为功能性探针,通过生信分析以及11b探针下拉实验表明,EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B这4种蛋白为BBR的潜在直接靶蛋白。

图1.靶蛋白捕获和功能分析

然后,作者用CETSA实验验证BBR与4种靶蛋白的相互作用,发现添加温度为35~75℃之间的BBR,四种蛋白的热稳定性均有不同程度的增强,表明BBR与这四种蛋白质之间可能存在直接相互作用。作者用SPR分析并使用软件对BBR与4种蛋白进行分子对接,再次验证了BBR与这四种靶蛋白之间的特异性相互作用,而EIF2AK2与BBR的亲和力最强。

图2.BBR与其潜在靶标之间的亲和力研究

由于EIF2AK2可以调节多种信号转导途径,并参与多种炎症相关疾病的调控,因此作者对EIF2AK2与BBR的相互作用模式和抗炎功能进行了深入研究。基于EIF2AK2与BBR之间的强亲和力,作者推测它们之间可能存在离子键,故选择了两个含有不同离子键相互作用的空腔,使用软件进行分子对接并结合氨基酸单点突变进行免疫印迹分析,结果表明,BBR可能直接靶向EIF2AK2的二聚化以调节抗炎作用。作者接着用免疫沉淀的方法进一步验证了BBR确实干扰EIF2AK2二聚化。直接靶向EIF2AK2二聚化或自磷酸化可能会导致不同的下游效应,为了进一步了解这种差异,作者用EIF2AK2自磷酸化抑制剂C16来测定EIF2AK2的抑制活性,结果表明,BBR可以通过靶向EIF2AK2二聚反应选择性地发挥相关活性来避免可能的毒性,说明BBR具有良好的安全性。

图3.EIF2AK2的功能研究

为了进一步了解EIF2AK2的功能作用,作者通过测量PMA-THP-1细胞中的IL-1β释放来验证NLRP3炎症小体的功能,结果发现BBR可能通过作用于EIF2AK2来抑制NLRP3表达和IL-1β的释放。由于EIF2AK2在脑组织中表达相对较高,作者进一步验证了EIF2AK2与人源性小胶质细胞炎症通路之间的相关性,正如预期,BBR可下调LPS诱导的p-NF-κB p65和p-JNK的升高,而BBR抑制p-NF-κB p65和p-JNK的作用在EIF2AK2被敲低后部分或完全丧失。但当EIF2AK2过表达时,p-NF-κB p65和p-JNK的BBR依赖性抑制被逆转。以上结果表明BBR可通过靶向EIF2AK2来影响脑炎症反应,并揭示了BBR在大脑中发挥抗炎作用的可能机制。此外,BBR可以抑制棕榈酸(PA)诱导的p-JNK水平上升,并上调HepG2细胞中SIRT1蛋白的表达,其中SIRT1是与脂质代谢密切相关的重要生物标志物,结果进一步表明,BBR可能通过与关键蛋白EIF2AK2结合来调节炎症诱导的脂质代谢紊乱。


图4.BBR靶点的功能研究

此外,作者选择了4个BBR靶标的经典验证相关途径进行功能验证,作者建立了这4种蛋白质在细胞水平上的过表达或敲低模型,以研究BBR是否以依赖性方式调节不同的经典炎症途径,如JNK,NF-κB,MAPK和AKT信号。通过一系列WB实验表明,BBR分别通过EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B依赖方式调节JNK、NF-κB、MAPK和AKT等多种信号通路,其中EIF2AK2起主导作用,随后,作者进行了体内实验来进一步确认。


图5.EIF2AK2体内功能验证

由于IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌与炎症小体NLRP3的表达、JNK和NF-κB通路的激活等密切相关,作者进一步论证了BBR是否通过靶向EIF2AK2来影响IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的体内释放。通过小鼠尾静脉注射腺相关病毒AAV-shEIF2KA2-GFP 成功建立了EIF2KA2敲低小鼠模型,以评估BBR对IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的影响。结果显示,BBR显著降低了对照组IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的产生,而BBR的作用在EIF2AK2敲低组中减弱,肝脏的H&E染色结果表明,BBR可减轻EIF2AK2敲低小鼠的肝脏组织的炎症浸润。简言之,BBR可能通过靶向EIF2AK2下调IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌,具有良好的安全性。


图6.BBR抗炎机制图

综上所述,作者确定了EIF2AK2可调节多种信号转导通路,包括AKT、JNK和NF-κB通路。同时,四个新确定的BBR抗炎作用的直接靶标(eEF1A1,PRDX3和VPS4B,EIF2AK2)是治疗几种炎症相关疾病的关键靶点,由于BBR通过多靶点网络机制发挥其多样化的药理活性,因此需要进一步探索更直接的靶点,明确每个靶点的贡献,以充分阐明复杂而巧妙的基因间的网络机制以及相应的生物学效应。此外,BBR能直接抑制EIF2AK2的二聚化,发挥协同抗炎作用,具有良好的安全性,因此,抑制EIF2AK2二聚化可能是炎症相关疾病的重要治疗靶点。


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